Méthode à haut débit pour l’observation des phénotypes de motilité chez Pseudomonas aeruginosa

Nos recherches portent sur la compréhension de la manière dont les bactéries agissent et causent les infections grâce à la biologie des systèmes et à la génomique. Nous visons à identifier les gènes qui influencent la physiologie bactérienne dans des conditions qui imitent l’environnement infectieux afin de trouver de nouvelles cibles pour développer de meilleurs antibiotiques et des traitements alternatifs. Nous avons développé un protocole à haut débit pour identifier les facteurs génétiques influençant la motilité de Pseudomonas aeruginosa, permettant une analyse génomique à l’échelle du génome des comportements d’essaim et de spasme. Cette initiative de recherche a mis au jour des mécanismes moléculaires à l’origine de la motilité qui contribuent également à la formation de biofilms, à la colonisation et à l’évasion de la défense de l’hôte.

Il est adaptable à différents tests et espèces bactériennes. Pour commencer, prenez les plaques sources de la bibliothèque de mutants transposons de Pseudomonas aeruginosa et laissez-les à plat sur une surface à température ambiante pendant environ une heure pour refroidir. Pour le test souhaité, sélectionnez des plaques de glucose M9 à 0,5 % d’agar pour l’essaim et des plaques d’agar LB à 1 % d’agar pour les spasmes.

Pour configurer le réplicateur pour un transfert précis de colonie, activez le réplicateur. Dans la section sélectionner et opérer le mode, choisir sélectionner et exécuter les programmes stockés. Dans la section, sélectionnez les plaques sources, sélectionnez plus la plaque 384 agar.

Ensuite, dans la section sélection de la plaque cible, sélectionnez plus la plaque 384 agar. Dans la section, sélectionnez les pavillons, sélectionnez la broche courte 384. Dans les programmes chanteurs, sélectionnez répliquer plusieurs, puis allez dans répliquer les options de programme et choisissez général, recycler, et aucun.

Dans la source de la section, sélectionnez décalage, puis aléatoire et rayon par défaut. Dans la cible de section, sélectionnez épingler et ajustez la pression à 2 % Laissez tous les autres réglages par défaut. Ensuite, insérez les RePads 384 à goupille courte dans le compartiment approprié.

Placez les plaques source et cible sur la plateforme désignée du réplicateur. Placez les plaques sources de densité 384 et les plaques de motilité vides sur la plateforme. Appuyez sur lancer en utilisant les paramètres sélectionnés pour commencer le processus de transfert.

Le robot de fixation de réseaux microbiens transférera les colonies des plaques sources de densité 384 vers les plaques de motilité. Ensuite, placez les plaques de motilité inoculées dans des sacs plastiques. Placez soigneusement les sacs contenant les assiettes dans l’incubateur, réglés à 37 degrés Celsius pendant 18 heures.

Après la période d’incubation, capturez des images haute résolution des plaques de motilité à l’aide de tout logiciel d’imagerie de haute qualité. Après avoir effectué le test de motilité et imagé les plaques de motilité, exécutez le macro dans ImageJ. Ouvrez le dossier contenant les images pour charger le lot afin d’analyser.

Lorsqu’on le demande, modifie l’angle en utilisant l’option d’aperçu jusqu’à ce que la plaque soit droite pour ajuster la rotation de la plaque. Lorsque vous êtes satisfait, cliquez sur le bouton d’accord. Ensuite, déplacez l’outil rectangulaire autour des colonies pour recadrer la partie de la plaque contenant les colonies.

Quand vous êtes prêt, cliquez sur OK pour terminer le recadrage. Définissez la grille utilisée pour tracer la région d’intérêt, ou ROI, autour de chaque colonie et mesurez la zone de motilité. Sélectionnez la densité de colonie appropriée et ajustez les paramètres selon les besoins pour s’assurer que chaque cercle est positionné autour d’une colonie.

Quand vous êtes prêt, activez la case d’accord et cliquez sur le bouton d’accord. La zone de motilité de chaque colonie sera mesurée, et un fichier CSV contenant les données sera sauvegardé dans le dossier désigné. Pour le test de motilité, autoclave une solution d’agar contenant M9, glucose, acides casamino et sulfate de magnésium.

Verser 25 millilitres d’agar refroidi et mélangé dans chaque plaque de Petri. Ensuite, inoculez chaque plaque avec 2,5 microlitres de culture bactérienne pendant la nuit et incubez à 37 degrés Celsius pendant 18 heures, les paupières orientées vers le haut pour observer les phénotypes de motilité. Après autoclaver une solution de LB avec 1 % de agar, versez 25 millilitres de LB 1 % d’agar refroidi et mélangé dans des plaques de Petri.

Poignardez les bactéries au fond des plaques en contraction contenant 1 % de agar. Faites couver les plaques à 37 degrés Celsius pendant 48 heures, puis à température ambiante pendant 48 heures supplémentaires. Après l’incubation, retirez soigneusement l’agar des plaques.

Visualisez la zone de spasmes en colorant la boîte de Petri avec une solution de violet cristallin à 1 %. Le test de motilité par spasmes a montré que les mutants de Pseudomonas aeruginosa présentant des délétions génétiques de la machinerie T4P présentaient des régions de halo significativement plus petites que le type sauvage, indiquant une motilité de spasme réduite. L’analyse de motilité par essaim a révélé que les mutants de délétion de la bibliothèque PA14 présentaient une réduction significative des régions de halo sans protubérance, confirmant une capacité défectueuse en essaim.

Les études sur la motilité bactérienne sont souvent limitées par leur débit. Notre protocole de motilité à haut débit aidera les chercheurs à étudier la motilité bactérienne de manière exhaustive. Par exemple, en utilisant une collection de mutants à l’échelle du génome, il devient possible d’identifier tous les gènes liés à la motilité et de révéler comment les bactéries causent des infections.

Nos découvertes soulèvent de nouvelles questions sur le contrôle génétique de la motilité chez Pseudomonas aeruginosa, son rôle dans la formation des biofilms et son lien avec la pathogenèse. Ils aident également à explorer comment les conditions environnementales influencent les comportements de motilité, et si le ciblage des gènes de motilité pourrait conduire à des thérapies antimicrobiennes innovantes.