Optimisation de l’administration de vésicules extracellulaires à l’aide d’un échafaudage bio-imprimé en 3D pour la gestion des plaies chroniques

L’objectif de la recherche est de développer une conception avancée de pansement bioactif pour une gestion efficace des plaies chroniques. L’échafaudage assurera le contrôle, la dégradation et la livraison locale efficace des vésicules extracellulaires.

Le protocole actuel vise à surmonter les limites du pansement conventionnel dans la gestion de l’inflammation chronique. En particulier, le manque de contrôle, la dégradation et la libération rapide des vésicules extracellulaires.

Ce protocole offre une approche Tuneable pour délivrer des agents thérapeutiques, y compris des gènes, en temps opportun pour diverses applications.

Tous les résultats fournissent de nouvelles perspectives sur la personnalisation d’un échafaudage pour divers types de plaies et sur l’amélioration des thérapies régénératives en chargeant les vésicules extracellulaires avec des molécules bioactives spécifiques.

Notre laboratoire va mettre en place une plateforme de recherche translationnelle pour aborder la cicatrisation des plaies diabétiques.

[Narrateur] Pour commencer, décongelez rapidement un flacon de cellules souches mésenchymateuses dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Retirez la fiole lorsqu’il reste un petit fragment de glace. Transférez tout le contenu du flacon de cellules souches mésenchymateuses dans un tube conique de 15 millilitres contenant un milieu complet. Centrifugez les cellules à 200 G pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu complet de préchauffage. Transférez ensuite les cellules dans une fiole T25 contenant quatre millilitres de milieu complet. Inclinez doucement le ballon T25 pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties. Incuber le ballon à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules ont atteint une confluence de 70 % à 80 %, aspirez le milieu épuisé de la fiole T25. Ajoutez trois millilitres de PBS frais dans le ballon pour éliminer les cellules résiduelles. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de trypsine à 0,25 % dans le ballon et incuber. Surveillez le décollement des cellules au microscope à un grossissement de 4x. Ajoutez maintenant quatre millilitres de milieu complet et préchauffé dans le ballon et pipetez de haut en bas sur la surface jusqu’à ce qu’ils se détachent. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans une centrifugeuse de 15 millilitres deux. Après la centrifugation, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu frais et complet et comptez les cellules. Transférez ensuite les cellules dans une fiole T75 avec une densité d’ensemencement de 5 000 cellules par centimètre carré. Incuber la fiole T75 à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après 72 heures, prélevez le milieu conditionné dans les cellules pour l’isolement des vésicules extracellulaires. Pour isoler les vésicules extracellulaires ou VE, centrifugez les 13 millilitres de milieu conditionné collecté à 800 G pendant 15 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Utilisez un filtre à seringue de 0,22 micromètre pour filtrer le surnageant et éliminer les grosses particules. Ajoutez maintenant cinq millilitres de tampon de précipitation au média conditionné filtré. Mélangez soigneusement pour vous assurer qu’il est homogène. Incuber le mélange pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre aux vésicules extracellulaires de précipiter. Ensuite, centrifugez le mélange à 3 220 G pendant 30 minutes à 20 degrés Celsius. S’assurer que les tubes sont équilibrés. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille et centrifugez-la à nouveau pendant cinq secondes. Maintenant, remet doucement en suspension la pastille EV dans 200 microlitres de PBS pour éviter d’endommager les vésicules. Effectuez un western blot pour détecter les marqueurs spécifiques des vésicules extracellulaires, notamment CD63, CD81 et CD9. Préparez une solution fraîche d’alginate de sodium à 4,5 % dans de l’eau stérile ultrapure. Remuez la solution pendant la nuit à 60 degrés Celsius pour assurer une dissolution complète. Ensuite, dissolvez la carboxyméthylcellulose dans de l’eau ultrapure stérile pour obtenir une solution à 3,8 %. Centrifugez les encres biologiques préparées à 3 220 g pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius pour éliminer les bulles qui peuvent interférer avec le processus d’impression. Utilisez maintenant un mélangeur à seringue et mélangez trois millilitres de la solution d’alginate de sodium préparée avec les VE étiquetés ou le contrôle Dialymmi. Bien mélanger doucement pour assurer une suspension uniforme. Utilisez un autre mélangeur à seringue pour combiner un millilitre de carboxyméthylcellulose avec une solution d’alginate Lyase fraîchement préparée dans de l’eau stérile ultrapure pour obtenir une concentration finale de 0,5 milli d’unités par millilitre. Chargez simultanément l’encre bio d’alginate de sodium EV dans la partie centrale et la bio-encre d’alginate de carboxyméthylcellulose Lyase dans la partie gaine de la configuration de la seringue. Lancez le logiciel de l’imprimante 3D bio. Sélectionnez une forme cylindrique avec un motif de remplissage diagonal pour créer la structure d’échafaudage. Réglez le diamètre du cylindre sur 20 millimètres et la hauteur sur 1,1 millimètre. Configurez la taille des pores à un millimètre. Réglez la vitesse de pompage du noyau et de la buse de la gaine à un millimètre par seconde avec une épaisseur de 0,25 millimètre par couche. Configurez la vitesse de déplacement à six millimètres par seconde et imprimez quatre couches à température ambiante. Utilisez un humidificateur avec du chlorure de calcium en aérosol pour réticuler l’échafaudage pendant le processus d’extrusion. Commencez à imprimer l’échafaudage sur un film polyester. Positionnez la buse de l’humidificateur à environ 20 centimètres de la tête d’extrusion pour assurer une réticulation efficace. Immergez l’échafaudage dans une solution de chlorure de calcium à 2,2 % pendant 10 minutes pour terminer la réticulation. Rincez l’échafaudage trois fois avec de l’eau stérile ultra-pure pour éliminer l’excès de chlorure de calcium et d’encre biologique non liée. Rasez la peau dorsale d’une souris diabétique OCTA anesthésiée avec une tondeuse électrique en évitant l’irritation ou les blessures cutanées. Créez maintenant une plaie cutanée circulaire de six millimètres sur toute l’épaisseur sur la surface dorsale de chaque souris. Placez délicatement l’échafaudage bio-imprimé en 3D contenant des vésicules extracellulaires marquées à la PKH sur le lit de la plaie. Assurez-vous que l’échafaudage recouvre complètement la surface de la plaie et appuyez légèrement avec une pince stérile pour minimiser les poches d’air. Transférez les souris anesthésiées vers le système d’imagerie IVIS deux heures, quatre heures, huit heures et 24 heures après l’implantation. Dans l’assistant d’imagerie, sélectionnez l’option d’imagerie par fluorescence et activez les filtres d’excitation et d’émission pour le colorant PKH. Ajustez les paramètres de l’appareil photo, y compris le champ de vision et la hauteur du sujet pour optimiser la détection du signal. Commencez à acquérir des images, enregistrez les données résultantes. Relâchez ensuite les signaux fluorescents des VE étiquetés. Les VE d’alginate dans l’échafaudage de l’alginate de carboxyméthylcellulose ont montré un profil de libération plus rapide que les VE d’alginate dans la carboxyméthylcellulose uniquement, en particulier aux points de temps de deux et quatre heures.