Etablissement d’un module de coculture tridimensionnelle de cellules épithéliales à l’aide de membranes nanofibreuses

Notre groupe de recherche utilise de l’alcool polyvinylique, PVA, et des membranes nanofibreuses poly epsilon-caprolactone, PCL, pour développer un système de coculture 3D. Il vise à expliquer comment les membranes soutiennent les cellules épithéliales et fibroblastiques, imite les environnements tissulaires et facilite l’étude des motifs, des signalisations et des interactions cellulaires. Nous montrerons que les membranes nanofibreuses poreuses électro-filées permettent aux cellules épithéliales de former du tissu épithélial, permettant aux multicouches et aux fibroblastes de se développer dans chaque matrice supplémentaire.

Les méthodes mettent en évidence comment un système 3D étendu peut fournir aux tissus en croissance de meilleurs environnements par rapport aux cultures traditionnelles et 2D. Nous proposons un système de coculture utilisant des cellules épithéliales différenciées. L’organisation à l’aide de cellules souches nécessite une procédure de différenciation complexe, mais notre modèle présente des avantages en termes de simplicité et de gain de temps dans le développement d’un système de coculture 3D.

Nous nous concentrons sur le dépassement de la limitation des échafaudages nanofibreux en combinant des membranes nanofibreuses avec des hydrogels de couche supérieure dans les cocultures. Pour commencer, ajoutez 0,02 gramme d’acide polyacrylique et un gramme de PVA dans une bouteille en verre propre contenant une barre magnétique. Ajoutez 7,8 millilitres d’eau distillée dans la bouteille, puis placez la bouteille sur un agitateur à assiette.

Une fois que la bouteille a refroidi à température ambiante, ajoutez-y 0,2 millilitre de glutaraldéhyde et replacez-la sur l’agitateur à plaque à 500 tr/min pendant 30 minutes à température ambiante. Utilisez une seringue de cinq millilitres pour l’électro-filage. Séparez les pistons des canons et nettoyez les petits débris de plastique à l’intérieur des cylindres et les pointes des pistons.

Ensuite, utilisez des aiguilles pour bloquer l’écoulement du liquide et versez la solution de PVA dans chaque cylindre de seringue. Assemblez les pistons dans les canons et retirez les aiguilles. Après avoir assemblé une nouvelle aiguille métallique de calibre 27, placez-la dans la machine à filer électro.

Enveloppez hermétiquement le collecteur avec du papier d’aluminium. Une fois que le panneau d’injection revient à sa position d’origine, réglez la machine d’électro-filature sur un volume d’injection de deux millilitres, un taux d’injection de six microlitres par minute, une vitesse de rouleau de 100 tr/min et une distance pointe-collecteur de 14 centimètres. Vérifiez le débit de liquide pour chaque pompe, puis faites fonctionner la machine d’électro-filature avec un potentiel électrique d’environ 12 kilovolts.

Une fois le processus d’électrofilage terminé, détachez la feuille contenant le tapis de fibres du collecteur. Stockez le tapis en nanofibres dans un déshydratant sous vide. Ajoutez 1,5 gramme de PCL et 8,5 millilitres de chloroforme dans une bouteille en verre propre.

Placez la bouteille sur un agitateur à plaque et dissolvez le PCL dans du chloroforme pendant 12 heures à température ambiante. Coupez un petit morceau de la membrane en nanofibres, enduisez-les d’une fine couche d’or en utilisant le processus de pulvérisation automatique pendant cinq minutes. Pour commencer, coupez le tapis de nanofibres PVA fabriqué en morceaux de la taille souhaitée pour l’insert de transpuits.

Préparez un petit plat contenant 1,5 millilitres d’acide chlorhydrique pur. Placez le plat avec l’acide chlorhydrique et les morceaux de nanofibres dans une chambre à vide et fermez le couvercle. Ouvrez ensuite la vanne connectée à la pompe à vide et attendez 10 secondes jusqu’à ce que les fumées d’acide chlorhydrique montent.

Fermez la vanne et traitez les membranes avec des vapeurs d’acide chlorhydrique pendant deux minutes. Après le traitement à l’acide chlorhydrique, ajoutez des gouttes d’eau distillée dans les membranes. Placez les membranes sur une lame de verre et retirez-les de la feuille.

À l’aide d’une coucheuse à pulvérisation automatique, enduire les membranes de ruban de carbone d’une fine couche d’or. Ensuite, lavez trois fois les nanomembranes PVA réticulées avec de l’acide chlorhydrique avec du PBS et faites-les tremper dans le milieu de culture. Après le trempage, vérifiez le pH pour confirmer l’absence d’acide chlorhydrique résiduel.

Pour commencer, coupez les tapis en nanofibres en morceaux ronds d’un diamètre de 10 millimètres pour les nanomembranes PVA et de 13 millimètres pour les nanomembranes PCL. Mélanger la base SYLGARD 184 et l’agent de durcissement dans un rapport massique de 10 pour un dans un gobelet en plastique. À l’aide d’une lame de verre propre, mélangez vigoureusement la solution de polydiméthylsiloxane, ou PDMS, pendant deux à trois minutes jusqu’à ce que des bulles se forment.

Répartissez uniformément le PDMS sur une lame de verre. Trempez bien le bord inférieur de l’insert légèrement dans le PDMS. Placez ensuite l’insert bien à l’envers sur le chauffe-lames pendant 10 à 15 minutes jusqu’à ce que le PDMS durcisse.

Vérifiez le PDMS avec une pointe de pipette de 200 microlitres pour vous assurer qu’il n’est plus collant. Maintenant, appuyez doucement sur le puits d’insertion sur la pièce de nanomembrane PVA, de sorte que le bas du puits d’insertion fasse face au côté nanofibre de la membrane. Ajoutez une goutte d’eau distillée au centre du puits et utilisez une pince pour retirer délicatement la feuille.

Ensuite, placez bien l’insert dans une nouvelle plaque à 24 puits et laissez la membrane sécher. Lors de la fixation de la pièce de nanomembrane, trempez une pointe de pipette de 200 microlitres dans le mélange PDMS et parsemez-la précisément aux quatre coins et au centre du puits. Placez la plaque sur le chauffe-lames et laissez le PDMS durcir pendant cinq à sept minutes.

Ensuite, placez le morceau de nanomembrane PCL dans le puits contenant le PDMS avec le côté nanofibre attaché au PDMS. À l’aide d’une petite brosse propre, appuyez légèrement sur le côté feuille de la membrane pour une fixation complète. Ajoutez ensuite 0,2 millilitre d’éthanol à 70 % dans le puits pour faciliter le retrait de la feuille.

Stérilisez l’insert et le puits inférieur dans la configuration transwell sous la lumière ultraviolette pendant la nuit. Le lendemain, lavez l’insert et le puits de fond en ajoutant 200 microlitres de PBS dans l’insert et 500 microlitres dans le puits de fond pendant trois cycles de 10 minutes chacun. Une fois que les cellules atteignent 70 à 80 % de confluence, lavez-les avec 10 millilitres de PBS et ajoutez deux millilitres de 0,05 % de trypsine EDTA pour les trypsiniser.

Tapotez doucement le plat pour déloger les cellules du bas. Ajoutez huit millilitres de milieu de culture complet pour neutraliser l’enzyme trypsine, puis transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifugez le tube à 400G pendant cinq minutes.

Après avoir jeté le supra natant, remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de DMEM complet avec un milieu F12. Remplissez ensuite le puits de fond avec 500 microlitres de média DMEM F12 complet. Transférez l’insert attaché à la membrane nanofibreuse PVA dans le puits de transfusion et ajoutez 50 microlitres de suspension de cellules MLE-12.

Ensuite, remplissez le puits inférieur de la membrane nanofibreuse PCL avec 500 microlitres de suspension de cellules NIH3T3. Après avoir incubé les cellules pendant deux heures, assemblez l’insert contenant la cellule MLE-12 et la cellule NIH3T3 contenant le puits inférieur dans la configuration de transpuits, La distribution spatiale des cellules NIH3T3 et des cellules MLE-12 dans le système de coculture était clairement distincte, avec des cellules NIH3T3 vertes dispersées à différentes profondeurs et des cellules MLE-12 rouges formant des couches. Les cellules NIH3T3 infiltrent la membrane nanofibreuse PCL et s’étendent le long des axes des nanofibres, tandis que les cellules MLE-12 adhèrent à la surface de la membrane nanofibreuse PDA et présentent une agrégation.