Name: Etablissement d’un module de coculture tridimensionnelle de cellules épithéliales à l’aide de membranes nanofibreuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Découvrez un système de coculture 3D utilisant des membranes nanofibreuses PVA et PCL pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode permet l'adhésion et la croissance d'épithéliums multicouches avec des fibroblastes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Système avancé de co-culture 3D à deux couches pour les cellules épithéliales et fibroblastiques

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsine/EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>100x Péniciline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>20x PBS</td><td>Solution LPS</td><td>CBP007A</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldéhyde</td><td>Biosesang</td><td>PC2031-050-00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 Anticorps ZO-1 conjugué</td><td>Invitrogen</td><td>339194</td><td></td></tr><tr><td>Diluant d’anticorps OP Quanto</td><td>Epredia</td><td>10129-576</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 kit de dosage</td><td>Donginbio</td><td>CCK-3000</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire (150x20)</td><td>SPL</td><td>20151</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Vert CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Rouge CMTPX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Samchun</td><td>C0584</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>Corning</td><td>CLS2980245</td><td></td></tr><tr><td>DMEM haute teneur en glucose</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Welgene</td><td>LM 002-05</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Bases de dessiccateur avec bride plane, filetage</td><td>DWK Life Sciences&nbsp ;</td><td>7.022 260</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Couvercle de dessiccateur en verre & Robinet</td><td>d’arrêt Daihan Science</td><td>SM.2444061</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Robinet d’arrêt, avec broche en PTFE</td><td>DWK Life Sciences&nbsp ;</td><td></td><td></td>10322671</tr><tr><td>Machine d’électrofilage</td><td>NanoNC</td><td>ESR200RD</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique, Pure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TMS-013-BKR&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Laser à fluorescence Module de scanner confocal K1-fluo</td><td>Systèmes de nanoscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel/monture</td><td>Biomeda&nbsp ;Corp.</td><td>M01</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Buse métallique 27G</td><td>NanoNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernis à ongles</td><td>Nature republic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Vector Laboratories Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFlour 488</td><td>abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>Serrure Syringe_Lure en plastique (10 mL)</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td>Poly(acide acrylique)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>323667</td><td></td></tr><tr><td>Poly(alcool vinylique)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Polycaprolactone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>Pure HCL</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique à balayage</td><td>SEC</td><td>SNE-4500M</td><td></td></tr><tr><td>Verre à lames</td><td>Marienfeld Superior</td><td>K15663717</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 set</td><td>omniscience OMNISCIENCE</td><td>OMNI.05255</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Lecteur multimode</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

etablissement d’un module de coculture tridimensionnelle de cellules épithéliales à l’aide de membranes nanofibreuses

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Ce protocole décrit les étapes critiques de la coculture des cellules épithéliales pulmonaires MLE-12 et des fibroblastes NIH3T3 en construisant un modèle à deux couches basé sur une membrane nanofibreuse (Figure 1). Ce modèle convient à l’imagerie de cellules vivantes, à l’immunohistochimie et à l’analyse quantitative des paramètres d’évaluation des cellules co-cultivées. D’autres types de cellules peuvent également être utilisés en optimisant la densité cellulaire et les conditions de croissance.
Le MEB montre la distribution uniforme des nanofibres de PVA fabriquées sans formation de billes (Figure 2A). Le diamètre des nanofibres PVA variait de 150 nm à 230 nm (180 ± 25 nm, moyenne ±écart-type (ET)). Les nanofibres des NM PCL électrofilées étaient orientées de manière aléatoire et ressemblaient structurellement au collagène (Figure 2B). La plupart des fibres des NM PCL avaient un diamètre compris entre 300 nm et 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Ainsi, la membrane nanofibreuse PVA avait des pores plus petits que la membrane nanofibreuse PCL.
Avant l’ensemencement, les cellules MLE-12 et NIH3T3 ont été colorées avec Cell-Tracker rouge et vert, respectivement, et ont été surveillées tout au long du processus de coculture. Comme le montre la figure 3, la distribution spatiale des cellules MLE-12 dans la chambre d’insertion et des cellules NIH3T3 dans la chambre inférieure a pu être observée distinctement. L’analyse de l’empilement de focales a révélé que les cellules NIH3T3 étaient dispersées et détectées à différentes profondeurs (102 ± 20 μm), tandis que les cellules MLE-12 formaient des couches d’une épaisseur de 80 ± 10 μm. Les cellules NIH3T3 infiltrent la membrane nanofibreuse PCL et s’étendent le long des axes des nanofibres, tandis que les cellules MLE-12 adhèrent à la surface de la membrane nanofibreuse PVA et présentent une agrégation (Figure 4). Ensuite, nous avons examiné l’organisation cytosquelettique des cellules NIH3T3 et des cellules MLE-12 par coloration à l’actine. Les cellules NIH3T3 cultivées sur une membrane nanofibreuse PCL montrent une distribution en projectile de filaments d’actine ressemblant à des cellules dans les tissus, et la coloration de l’actine dans les cellules MLE-12 cultivées sur une membrane nanofibreuse PVA montre des agrégats ronds sans étalement cellulaire (Figure 5).
La distribution et le modèle de croissance des cellules MLE-12 en monoculture et en coculture ont été comparés. Les cellules colorées en rouge de Cell-Tracker en monoculture sur les NM PVA ont formé des agrégats, mais les cellules en coculture ont maintenu une distribution uniforme sur la membrane (Figure 6A). Dans une analyse 3D d’images de microscopie confocale, le profil de croissance des cellules MLE-12 cocultivées sur les NM PVA montre une adhésion en couches des cellules cultivées à la membrane avec une densité cellulaire plus confluente, par rapport aux cellules cultivées en l’absence de fibroblastes (Figure 6B). De plus, l’adhésion de cellule à cellule et l’expression de l’occludine zonale (ZO)-1 à la surface des cellules (flèche indiquée), mais pas des agrégats cellulaires, étaient plus évidentes dans la condition de coculture que dans la culture sans fibroblastes (Figure 6C).
La prolifération des cellules sur les membranes a été mesurée à l’aide du test CCK-8. La prolifération des cellules NIH3T3 et MLE-12 a augmenté avec le temps (Figure 7). Cependant, des taux de croissance plus faibles des cellules ont été observés sur les membranes que sur une plaque de culture (données non présentées). Les cellules NIH3T3 et MLE-12 cocultivées sur des NM présentent un taux de croissance stable par rapport aux cellules monocultivées dans une plaque de culture.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig01.jpg"> 
Figure 1 : Schéma illustrant la méthode de co-culture de fibroblastes NIH3T3 et de cellules épithéliales MLE-12 dans le système à deux couches basé sur un échafaudage. Abréviations : PVA = alcool polyvinylique ; PCL = poly(ε-caprolactone). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig02.jpg"> 
Figure 2 : Structure des nanofibres de PVA et PCL. (A) Les membranes nanofibreuses de PVA et (B) de PCL ont été produites par électrofilage. La structure et le diamètre des nanofibres sont mesurés par MEB des surfaces de la membrane. Barres d’échelle = 1 μm (A), 10 μm (B). Abréviations : PVA = alcool polyvinylique ; PCL = poly(ε-caprolactone). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig03.jpg"> 
Figure 3 : Dans un système de coculture, la distribution spatiale des cellules NIH3T3 sur la membrane nanofibreuse PCL et des cellules MLE-12 sur la membrane nanofibreuse PVA. Les cellules NIH3T3 (4 × 105) ont été colorées avec Cell-Tracker Green, et les cellules MLE-12 (3 × 105) ont été colorées avec Cell-Tracker Red. Les cellules ensemencées ont été cultivées pendant 24 h et observées à l’aide d’une image d’empilement Z d’un microscope confocal. Les chiffres sont indiqués en μm ; Les flèches indiquent les dimensions avec x (largeur), y (longueur), z (profondeur). Abréviations : PVA = alcool polyvinylique ; PCL = poly(ε-caprolactone). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig04.jpg"> 
Figure 4 : Adhésion et morphologie des cellules NIH3T3 sur la membrane nanofibreuse PCL et des cellules MLE-12 sur membrane nanofibreuse PVA. Les cellules ont été cultivées sur les membranes pendant 24 h et observées à l’aide d’un MEB à un grossissement de 2 000x. Barres d’échelle = 15 μm. Abréviations : PVA = alcool polyvinylique ; PCL = poly(ε-caprolactone). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig05.jpg"> 
Figure 5 : Fibres de stress d’actine dans les cellules NIH3T3 sur la membrane nanofibreuse PCL et les cellules MLE-12 sur la membrane nanofibreuse PVA. Les cellules NIH3T3 (4 × 105) et les cellules MLE-12 (3 × 105 cellules) ont été ensemencées sur les membranes nanofibreuses PCL et PVA, respectivement. Après 48 h de culture, les cellules ont été colorées avec de la phalloïdine-iFlour 488 et observées par microscopie confocale. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : PVA = alcool polyvinylique ; PCL = poly(ε-caprolactone) ; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig06.jpg"> 
Figure 6 : Schéma de croissance de cellules MLE-12 co-cultivées sur une membrane nanofibreuse PVA. (A) Des cellules MLE-12 colorées en rouge Cell-Tracker (3 × 105 cellules) ont été ensemencées sur la membrane nanofibreuse PVA et cultivées seules (cellules -NIH3T3) et avec des cellules NIH3T3 dans un système à deux couches (+cellules NIH3T3) pendant 48 h. (B) Des cellules MLE-12 monocultivées et co-cultivées pendant 48 h ont été colorées avec Hoechst 33342 (bleu) et Phalloidin-iFlour 488 et observées à l’aide d’un microscope confocal. Les images 3D sont affichées à l’aide de la fonction de surface du logiciel Imaris. (C) Les cellules MLE-12 ont été cultivées pendant 48 h et marquées par fluorescence avec de la phalloïdine-iFlour 488 et un anticorps anti-ZO-1 (rouge). Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : PVA = alcool polyvinylique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig07.jpg"> 
Figure 7 : Taux de croissance des cellules dans un système de coculture à deux couches. Les cellules NIH3T3 (4 × 10,5) et MLE-12 (3 × 10,5) sont co-cultivées pendant la durée indiquée. La croissance cellulaire dans l’insert et le puits de fond est mesurée à l’aide du test CCK-8. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Etablissement d’un module de coculture tridimensionnelle de cellules épithéliales à l’aide de membranes nanofibreuses

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

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Bioengineering

Bioingénierie

Une méthode simple est décrite pour analyser les effets de fibroblastes de tissus sur les cellules épithéliales associées. La combinaison de cette méthode et la culture de tissus en trois dimensions peut faciliter l'analyse des cellules après l'isolement de la 3D. La technique est applicable à des cellules plus ou moins de potentiel malin, permettant l'étude systématique des effets de associé à une tumeur du stroma sur les cellules tumorales.

Isolement des cellules épithéliales mammaires à partir de trois dimensions de cellules mixtes Sphéroïde Co-culture

Les progrès des technologies des biomatériaux permettent le développement de constructions tridimensionnelles de type multicellulaire. Nous avons développé des protocoles d’électrofilage pour produire trois échafaudages individuels afin de cultiver les principales cellules structurelles des voies respiratoires afin de fournir un modèle 3D in vitro de la paroi bronchiole des voies respiratoires.

Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle du mur Airway

Ce manuscrit décrit une technique à base de lithographie douce pour concevoir des tableaux uniformes en trois dimensions (3D) tissus épithéliaux de géométrie définie entourées par la matrice extracellulaire. Cette méthode se prête à une grande variété de types de cellules et dans des contextes expérimentaux et permet un criblage à haut débit de répétitions identiques.

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

Les modèles actuels de culture bicouche ne permettent pas des études fonctionnelles in vitro qui imitent en vivo microenvironnements. À l’aide de polyéthylène glycol et une méthode de création de modèles d’oxyde de zinc, ce protocole décrit le développement d’une membrane de sous-sol biomimétique ultra-mince avec rigidité ajustable, la porosité et la composition biochimique qui imite étroitement en vivo matrices extracellulaires.

Hydrogels ultraminces évaluation élastique comme une Membrane de sous-sol biomimétiques pour Dual Culture cellulaire

Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir des systèmes 3D-culture en auto-assemblage peptide échafaudages pour promouvoir la différenciation des chondrocytes articulaires humains dédifférenciées en tissu cartilagineux.

Culture de cellules mammifères dans les échafaudages de Peptide en trois dimensions

Ce protocole décrit l'isolement des cellules épithéliales de différentes régions anatomiques de la membrane amniotique humaine pour déterminer leur hétérogénéité et leurs propriétés fonctionnelles pour l'application possible dans les modèles cliniques et physiopathologiques.

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

Le protocole présenté décrit le développement et l’utilisation d’une technique de coloration filamenteuse à base de phalloïdine avec microscopie confocale à balayage laser (CLSM) pour visualiser la structure de la couche cellulaire adhérente dans les canaux de culture dynamique microfluidique et les chambres de culture statique traditionnelles à puits fixes. Cette approche aide à évaluer la confluence de la couche cellulaire, la formation de monocouches et l’uniformité de l’épaisseur de la...

Préparation et évaluation structurale de monocouches de cellules épithéliales dans un dispositif de culture microfluidique de taille physiologique

Les inserts de culture tissulaire avec membranes en plastique sont la référence dans les laboratoires de culture cellulaire en tant que supports perméables pour établir des couches cellulaires et des modèles de tissus barrières. Ici, nous présentons une méthode simple pour remplacer la membrane plastique par une membrane plus pertinente sur le plan biologique, fabriquée à partir d’une protéine de soie d’araignée fonctionnalisée recombinante.

Membrane basale nanofibrillaire en soie d’araignée fonctionnalisée recombinante dans des inserts de culture tissulaire sur mesure

Un protocole de scellement novateur pour produire des joints étanches à base de silicone pour les membranes de dispositifs à puces polydiméthylsiloxane (PDMS). Destiné aux laboratoires, à la mise en place de modèles de puces et au développement de plateformes de puces à petite échelle. Nous démontrons le protocole en utilisant des membranes tissulaires plastiques et natives. Cette procédure ne nécessite que le PDMS, le toluène, le moule, la membrane et une chambre à vide.

Procédure d’étanchéité silicone accessible entre la puce et la membrane pour une liaison flexible et fiable

Optique résolution microscopie photoacoustique (OR-PAM) est une technologie émergente capable d'imagerie d'absorption optique des...

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Découvrez un système de coculture 3D utilisant des membranes nanofibreuses PVA et PCL pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode permet l'adhésion et la croissance d'épithéliums multicouches avec des fibroblastes.

Etablissement d’un module de coculture tridimensionnelle de cellules épithéliales à l’aide de membranes nanofibreuses

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