Extraction du module de Young des membranes basales pulmonaires murines natives à partir de cartes de force dérivées de la microscopie à force atomique

Dans nos recherches, nous étudions l’influence des propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire sur le comportement cellulaire et l’intégrité des tissus. Nous voulons comprendre comment l’interaction entre les cellules et leur microenvironnement affecte les processus pathologiques tels que la formation de métastases. En explorant les propriétés mécaniques de la membrane basale pulmonaire, nous avons découvert que les membranes basales plus molles sont plus résistantes à l’invasion des cellules cancéreuses.

La méthode présentée dans notre protocole permet la cryosection et l’investigation mécanique d’échantillons biologiques non fixés, ce qui préserve les propriétés mécaniques. De plus, il montre un moyen de déterminer le module de Young uniquement de la membrane basale à l’intérieur de la paroi alvéolaire par une mesure au microscope à force atomique et les procédures de filtrage décrites dans notre protocole. La prochaine étape consiste à en apprendre davantage sur la dynamique de la rigidité de la membrane basale et son rôle dans les processus développementaux et pathologiques afin d’améliorer potentiellement le diagnostic et d’orienter les options de traitement.

Pour commencer, retirez le moule contenant les tissus pulmonaires de souris composés de température de coupe optimale congelés, ou OCT, du congélateur à moins 80 degrés Celsius. Placez du ruban adhésif double face au centre de la lame de microscope à bord givré. Enroulez un tube à centrifuger de 15 millilitres sur le ruban pour assurer une adhérence ferme et sans bulles.

Assurez-vous que la longueur de la bande correspond à la largeur du bloc OCT contenant l’échantillon. Étiquetez les lames avec un crayon, y compris les informations sur l’échantillon et les numéros de section. Insérez les lames de microscope préparées dans une boîte à lames.

Placez la boîte à lames à l’intérieur de la chambre du cryotome pour refroidir les lames. Ensuite, remplissez les deux anneaux intérieurs du porte-échantillon avec un milieu OCT. Positionnez l’échantillon dans le milieu OCT sur le porte-échantillon.

Placez le porte-échantillon dans la chambre du cryotome pendant environ 10 minutes jusqu’à ce que le milieu OCT se solidifie complètement et que l’échantillon soit solidement fixé. Installez maintenant le porte-échantillon sur l’étage de découpe du cryotome. Fixez un morceau de ruban adhésif unilatéral à l’échantillon en appuyant fermement avec un pouce froid.

Produisez une coupe de tissu de 15 micromètres à l’aide du cryotome. Utilisez une brosse pour diriger la section et empêcher le ruban adhésif de se détacher pendant la procédure de coupe. Utilisez une lame de microscope réfrigérée avec du ruban adhésif double face et appuyez fermement sur la section pour la ramasser.

Replacez la diapositive portant la section dans la boîte à glissières. Pour calibrer le porte-à-faux à l’aide de la méthode du bruit thermique, placez une lame de microscope sur la platine d’échantillonnage du microscope à force atomique, ou AFM. Placez la tête AFM sur la platine d’échantillonnage.

Abaissez ensuite la tête AFM à l’aide des moteurs pas à pas jusqu’à ce que l’espace entre le support en porte-à-faux et la lame de microscope soit d’environ un à deux millimètres. À l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une longue aiguille, appliquez du PBS sur le côté du support en porte-à-faux, en lui permettant de s’écouler vers le bas et de former un ménisque fluide dans l’espace. Dans le logiciel de contrôle AFM, pour effectuer un étalonnage basé sur le contact, accédez à la page Acquérir les données et sélectionnez l’option Vue avancée.

Accédez au gestionnaire d’étalonnage en cliquant sur le bouton de menu burger situé dans le coin supérieur droit. Sélectionnez ensuite Basée sur le contact comme méthode et MLCT-F cantilever dans le menu déroulant Nom comme nom de cantilever. Entrez un volt dans le champ Point de consigne et 10 dans le champ Nombre de balayages.

Sur la page Acquérir les données, entrez un point de consigne d’un volt pour la procédure d’approche automatique dans le panneau de commande de gauche. Cliquez sur le bouton fléché bleu pointant vers le bas dans le coin supérieur gauche de l’interface pour lancer l’approche automatique. Lorsque l’approche est terminée et que le cantilever est en contact avec la lame de microscope, cliquez sur le bouton Calibrer dans la fenêtre du Gestionnaire d’étalonnage pour démarrer l’étalonnage.

Une fois l’étalonnage terminé, fermez la fenêtre du Gestionnaire d’étalonnage et assurez-vous qu’un fichier d’étalonnage est généré dans le répertoire présélectionné contenant les résultats d’étalonnage déterminés. Pour commencer, récupérez de la congélation la lame d’échantillon contenant des tissus pulmonaires de souris sectionnés. Placez la lame de microscope sur la platine d’échantillonnage de l’AFM.

Cliquez sur le bouton avec l’icône de la clé dans le coin supérieur droit de l’interface utilisateur pour accéder au gestionnaire de paramètres. Dans la section Paramètres d’approche, réglez la hauteur cible sur quatre micromètres. Ensuite, dans la section Paramètres du mode actuel sous Paramètres de retour avancés, réglez le multiplicateur sur un.

Dans la sous-section Forcer les paramètres des paramètres du mode actuel, sélectionnez Piézo rétracté dans le menu déroulant Mode à la fin. Dans le panneau de commande de gauche, définissez les paramètres des courbes d’indentation de force. Pour le NanoWizard 4 XP et le MLCT cantilever F, entrez le point de consigne à cinq nanonewtons, la longueur Z à huit micromètres et la vitesse Z à 300 micromètres par seconde.

Ensuite, définissez l’emplacement et la taille de la carte de force de vue d’ensemble initiale pour englober l’ensemble de la paroi alvéolaire, s’étendant d’un côté de l’air à l’autre. Réglez le nombre de pixels sur 50 par 50. Après avoir enregistré la carte d’ensemble, capturez une carte de force plus ciblée avec une taille de trois micromètres sur trois ou quatre micromètres sur la membrane basale, en maintenant le nombre de pixels à des courbes de 50 par 50.

Pour analyser les courbes d’indentation de force, lancez la boîte à outils de traitement CANTER dans MATLAB et ouvrez l’application Analyse de courbe de force. Ensuite, pour charger la carte de force haute résolution de la section pulmonaire, cliquez sur Sélectionner un fichier, accédez à l’emplacement de sauvegarde, double-cliquez sur le fichier et sélectionnez Charger les données. Lorsque la fenêtre contextuelle demandant les valeurs d’étalonnage du cantilever apparaît, saisissez les valeurs d’étalonnage dans les champs d’édition respectifs.

Cliquez sur le bouton Soumettre pour continuer. Dans une deuxième fenêtre contextuelle, poursuivez la procédure de chargement de la carte d’imagerie quantitative en cliquant sur le bouton Soumettre. Une fois le processus de chargement terminé, la courbe de force initiale de la carte de force s’affiche à l’écran.

Réglez la profondeur d’ajustement dans le champ d’édition correspondant sur 1,5 micromètre et sélectionnez via Hertz fit pour l’algorithme de recherche de contact. Pour appliquer l’ajustement du modèle Hertz modifié à toutes les courbes d’indentation de force de la carte QI, cliquez sur le bouton Continuer à appliquer à tous. Une fois la dernière analyse de la courbe de force terminée, une fenêtre s’affiche pour enregistrer les fichiers.

Cliquez sur Oui et entrez un nom pour les fichiers de résultats. Pour le filtrage spatial de la carte QI à partir de la fenêtre Sélection d’application de la boîte à outils de traitement CANTER, sélectionnez l’outil de filtrage des résultats et cliquez sur le bouton Démarrer l’application. Pour charger les résultats de l’ajustement, cliquez sur Ouvrir dans la barre de menu supérieure de l’interface utilisateur de l’outil de filtrage des résultats.

Dans la fenêtre contextuelle suivante, localisez le premier bouton Définir sous l’onglet JPK Maps et sélectionnez le fichier tsv contenant les résultats de l’analyse de la courbe de force. Cliquez ensuite sur le deuxième bouton Set et localisez le fichier de mappage QI correspondant au fichier tsv sélectionné. Cliquez ensuite sur Soumettre pour charger les données de la carte et les résultats de l’analyse de la courbe de force.

Dans le menu déroulant Canal affiché en haut, sélectionnez l’option EModul pour afficher les résultats du module de Young sous forme d’image de carte. Ensuite, dans le menu déroulant Canal de données sous le graphique de l’histogramme, choisissez l’option EModul pour visualiser la distribution des valeurs du module de Young chargées de la carte QI. Ensuite, cliquez sur le bouton fléché Flux de manipulation au centre de l’interface utilisateur, en vous assurant qu’il pointe vers le côté droit.

Réglez le bouton bascule Filtre d’image sur la position On (Activé) dans le panneau Filtre, au-dessus des axes de l’histogramme. Dans le menu déroulant Filtrer la géométrie, sélectionnez l’option À main levée, puis cliquez sur le bouton Ajouter. Sur l’image du canal supérieur, dessinez le masque de filtre en faisant le tour de la membrane sous-jacente tout en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé.

Relâchez ensuite le bouton de la souris lorsque vous avez terminé et double-cliquez sur le masque pour l’appliquer à la carte. Pour enregistrer un nouveau fichier de résultats tsv avec les valeurs de module de Young masquées, cliquez sur Enregistrer, Enregistrer l’histogramme et Enregistrer les données dans la barre de menu supérieure. Dans la fenêtre contextuelle qui s’affiche, cliquez sur Sélectionner tout pour choisir les résultats à écrire dans le fichier tsv.

Cliquez ensuite sur le bouton OK pour confirmer la sélection. Dans la boîte de dialogue Enregistrer, entrez un nom pour le fichier tsv, choisissez l’emplacement d’enregistrement souhaité, puis cliquez sur OK pour enregistrer les résultats filtrés. Les valeurs du module de Young de la membrane basale pulmonaire présentaient une distribution log-normale avec une valeur maximale de 9,31 et un écart-type de 0,18, ce qui donnait un module de Young représentatif de 11,05 kilopascals.

Ces résultats ont été confirmés par le graphique quantile-quantile.