Name: Extraction du module de Young des membranes basales pulmonaires murines natives à partir de cartes de force dérivées de la microscopie à force atomique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Découvrez comment extraire le module de Young des membranes basales pulmonaires murines par microscopie à force atomique. Cette méthode préserve les propriétés mécaniques natives et aide à comprendre l'invasion cellulaire cancéreuse.

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<table><tbody><tr><td>1 mL Seringue</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Injekt-F</td></tr><tr><td>10 mL Seringue</td><td>B Braun</td><td>4606108V</td><td>Injekt Luer Solo</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>Bouchon à vis</td></tr><tr><td>Tube Cantilever - MLCT</td><td>Bruker AFM Sondes</td><td>3444</td><td>AFM Cantilever avec une pointe pyramidale</td></tr><tr><td>Lames de cryotome</td><td>Leica Biosystems</td><td>14035843496</td><td>Lames jetables à profil bas DB80LX Porte-échantillon</td></tr> de <tr><td>cryotome</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047740044</td><td>Disque d’échantillon 30</td></tr><tr><td>Cyotome</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1950</td><td>Leica Cryostat</td></tr><tr><td>Direct Overlay Extension</td><td>Bruker</td><td></td> Software <td>extension pour le logiciel JPK SPM qui permet d’importer l’image optique du microscope inversé dans le Data Viewer du logiciel SPM.</td></tr><tr><td>Moule à base jetable</td><td>Science Services</td><td>SA62534-15</td><td>Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm</td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face</td><td>tesa</td><td>Film 56661-00002</td><td>Ruban photo</td></tr><tr><td>Support en porte-à-faux à ressort fixe</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé - Leica DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK Platine motorisée</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 4XP BioScience</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK SPM Software</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K5 CMOS Microscope Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Version R2024a ou supérieure</td></tr><tr><td>MATLAB - Curve Fitting Toolbox&nbsp ;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Boîte à outils de traitement d’images</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Boîte à outils de traitement du signal&nbsp ;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Statistiques et Machine Learning Boîte à outils</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Carl Roth</td><td>H869.1</td><td>Lames de microscope simples pour étalonnage en porte-à-faux</td></tr><tr><td>Lames de microscope - bord dépoli</td><td>Carl Roth</td><td>H870.1</td><td>Lames de microscope avec bord dépoli pour cryosection</td></tr><tr><td>Aiguille & barre oblique ; 0,9 mm & fois ; 25 mm</td><td>B Braun</td><td>4657500</td><td>OCT injection&nbsp ; dans l’échantillon pulmonaire</td></tr><tr><td>Aiguille & oslash ; 0,9 mm & fois ; 70 mm</td><td>B Braun</td><td>4665791</td><td>Aiguille longue pour appliquer le PBS sous le composé AFM</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek O.C.T. Composé</td></tr> de <tr><td>phosphate tamponné Saline</td><td>Bio& Vendre</td><td>la solution BS.L1825</td><td>PBS sans Ca2+, Mg2+, 500 mL</td></tr><tr><td>QI Advanced Imaging Extension</td><td>Bruker</td><td></td> Software <td>extension pour le logiciel JPK SPM qui fournit pour chaque pixel de l’image enregistrée l’ensemble de la courbe de force sous-jacente.</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>B Braun</td><td>5518083</td><td>Ciseaux chirurgicaux à usage unique</td></tr><tr><td></td><td>Kaut-Bullinger</td><td>M681700</td><td>Ciseaux précis 13 cm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ruban adhésif simple face</td><td>tesa Film</td><td>57330-00000</td><td>ruban transparent comme du cristal, 33 m x 19 mm</td></tr><tr><td>Boîte à diapositives</td><td>GWL Storing Systems</td><td>K50W</td><td>Boîte à diapositives pour 50 lames</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope - Stemi DR1663</td> Pince à épiler <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Vomm SS-SA-ESD</td><td>Eleshop</td><td>ELE002121</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction du module de young des membranes basales pulmonaires murines natives à partir de cartes de force dérivées de la microscopie à force atomique

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

Après l’identification et la mesure d’une paroi alvéolaire intacte, le résultat principal de ce protocole est les valeurs filtrées du module de Young du BM. Il est important de noter qu’il n’est pas possible de trouver une paroi alvéolaire appropriée pour la mesure de l’AFM dans chaque section de tissu. Dans nos observations expérimentales, environ 75 % des cryosections dérivées d’échantillons de poumons murins présentaient une paroi alvéolaire quantifiable. Pour déterminer avec précision la distribution spatiale du module de Young dans une BM pulmonaire, nous vous conseillons d’utiliser des cartes de force couvrant soit 3 μm x 3 μm ou 4 μm x 4 μm. Cette approche garantit une résolution suffisante pour l’examen des BM pulmonaires de souris, qui mesurent généralement de 100 à 200 nm d’épaisseur. Par conséquent, l’approche expérimentale consiste à capturer des courbes de force de 50 x 50 pour chaque carte de force, ce qui donne un total de 2 500 courbes de force. Dans la carte des forces, les courbes de force sont régulièrement espacées. Cela implique qu’en plus du module de Young du BM, les structures tissulaires entourant le BM sont sondées même dans les petites cartes de force. Par conséquent, afin de déterminer avec précision et sélection le module de Young exclusivement de la BM pulmonaire, nous avons mis en œuvre un processus de filtrage en deux étapes dans ce protocole.
L’étape initiale de filtrage du filtrage spatial dépendant de l’opérateur sélectionne les résultats d’ajustement de la courbe de force provenant de la BM pulmonaire murine, représentant environ 10 % à 25 % des valeurs totales des résultats contenues dans la carte de force analysée. Après ce filtrage spatial initial, environ 250 à 625 résultats d’ajustement sont conservés pour une analyse plus approfondie. L’étape de filtrage suivante permet de s’assurer que seuls les résultats liés à la BM provenant des courbes de force décrites de manière adéquate par le modèle Hertz modifié sont inclus. Par conséquent, le coefficient de détermination (R2) de l’ajustement du modèle Hertz modifié est utilisé comme critère de filtre. Notre expérience empirique suggère que le maintien des résultats avec des valeurs R2 supérieures à 0,96 convient aux résultats d’ajustement obtenus en adhérant à ce protocole. Il est important de noter que la valeur R2 est significativement influencée par la qualité (douceur) et la longueur de la ligne de base de la courbe de force, la détermination du point de contact et la convergence du modèle ajusté. Après l’application des deux procédures de filtrage, il reste généralement environ 100 à 500 valeurs de module de Young pour la BM d’une seule paroi alvéolaire.
La distribution de ces valeurs restantes du module de Young à partir du BM peut être visualisée à l’aide d’un histogramme (Figure 4A). Il est important de noter que les valeurs résultantes du module de Young de la BM pulmonaire suivent une distribution log-normale, qui est couramment observée pour les variables aléatoires qui ne peuvent atteindre que des valeurs positives61. Ceci est visualisé par le graphique QQ de la figure 4B. Par conséquent, une distribution normale (gaussienne) peut être ajustée à la distribution des valeurs du module de Young (E) transformée en logarithme. Ici, le logarithme népérien (ln) a été utilisé pour transformer les valeurs E . La position de crête de la distribution (μ) et de l’écart-type (σ) a été extraite de cet ajustement et ensuite retransformée pour obtenir le module de Young représentatif, noté EBM, à l’aide de l’équation suivante :
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq01.jpg" style="margin: auto;">
Notez qu’à la suite de la retransformation, l’intervalle de l’écart-type n’est plus symétrique autour de la valeur de crête. Les arêtes négatives (σ-) et positives (σ+) de l’intervalle type peuvent être calculées à l’aide des expressions suivantes :
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq02.jpg" style="margin: auto;">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq03.jpg" style="margin: auto;">
Ces équations sont une conséquence du fait que la fonction exponentielle est la fonction inverse du logarithme népérien62.
Après retransformation de la valeur de crête μ = 9,31 et de l’écart-type σ = 0,18 déterminés à partir de l’histogramme de la figure 4A, la valeur représentative du module de Young est EBM = 11,05 kPa avec un intervalle d’écart-type de [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. Alternativement, une distribution log-normale peut être ajustée à l’histogramme des valeurs non transformées du module de Young (E) pour déterminer les paramètres caractéristiques de la distribution.
Il est recommandé d’analyser au moins quatre parois par souris pour obtenir un résultat représentatif robuste, comme nous l’avons montré en détail dans Hartmann et al.59. Pour déterminer le module de Young représentatif EBM pour une souris, les valeurs transformées en logarithme des quatre parois ont été tracées dans un histogramme et une μ combinés et σ ont été déterminées en ajustant une distribution normale. Par la suite, μ et σ sont retransformés comme décrit précédemment pour récupérer EBM et l’intervalle d’écart type pour la souris sujete.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig01.jpg"> 
Figure 1 : Vue d’ensemble des principales étapes du protocole pour déterminer le module de Young d’une membrane basale pulmonaire murine. La première étape consiste à obtenir et à préparer des poumons murins, puis à les intégrer. Par conséquent, le poumon est injecté avec une combinaison de milieu OCT et de PBS, puis complètement immergé dans le composé OCT. Ensuite, des coupes de tissu pulmonaire de 15 m d’épaisseur sont obtenues par cryosectionnement avec un cryotome. Dans ce protocole, nous détaillons le processus d’utilisation de rubans adhésifs unilatéraux et bilatéraux pour fixer les échantillons en place pendant le processus de découpe. Par la suite, les valeurs du module de Young du BM sont déterminées par des mesures de la carte de force AFM sur les sections de tissus. Après l’achèvement du processus d’analyse de la courbe de force, un filtrage spatial et R² est appliqué pour isoler les résultats du module de Young de la structure d’intérêt, en particulier le BM (indiqué en vert sur la carte de force et quantifié dans la distribution du module de Young transformée en logarithme). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig02.jpg"> 
Figure 2 : Une expérience AFM exemplaire de carte de force menée sur une coupe de tissu pulmonaire murin. (A) Image de synthèse en microscopie à fond clair d’une section de tissu pulmonaire murin, permettant d’identifier des parois alvéolaires intactes appropriées situées entre deux alvéoles. Sur le côté droit de l’image, le porte-à-faux F du MLCT de forme triangulaire est visible. (B) Vue agrandie d’une paroi sélectionnée à l’intérieur de la section du tissu. (C) Canal de pente et (D) de hauteur d’une carte d’ensemble de 15 x 15 μm contenant 50 x 50 courbes de force de la paroi alvéolaire. Dans le canal de pente, le BM peut être identifié par une ligne brillante (flèche blanche), indiquant une structure de rigidité accrue à l’intérieur du mur. Le canal en hauteur confirme l’intégrité du mur, ne montrant aucun signe de rupture. Suite à l’identification du BM dans la carte d’ensemble 15 x 15 μm, une carte plus petite de 4 x 4 μm (E : canal de pente, F : canal de hauteur) avec des courbes de force de 50 x 50 est enregistrée. Barres d’échelle : (A) 200 μm et (B-D) 25 μm. Les gammes des échelles de couleurs des images AFM montrées sont les suivantes : (C) 2,36 - 9,29 nN/μm, (D) 0 - 3,38 μm, (E) 2,36 - 9,29 nN/μm (image d’ensemble) et 2,42 - 8,37 nN/μm (image plus petite), (F) 0 - 3,38 μm (image d’ensemble) et 0 - 1,99 μm (image plus petite), de sombre à clair. Des échelles de couleurs linéaires ont été utilisées pour toutes les images AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig03.jpg"> 
Figure 3 : Visualisation de la procédure de filtrage spatial. (A) La carte de module de Young résultant de l’analyse de la courbe de force, telle qu’elle est montrée dans l’outil de filtrage des résultats pour permettre le filtrage spatial des résultats. Le BM est identifiable par une bande brillante (valeurs de module de Young élevées) entourée de compartiments de tissus plus mous. (B) Histogramme des valeurs du module de Young correspondant à l’application non filtrée (A). Après l’application (C) du masque de filtre spatial (zone verte), (D) l’histogramme comprend exclusivement les valeurs du module de Young de la région en surbrillance verte, qui a été identifiée comme la BM. Notez que les valeurs douces résiduelles observables sur le côté gauche de l’histogramme peuvent être attribuées à des ajustements peu convergents, qui seront éliminés lors de l’étape de filtrage R² suivante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig04.jpg"> 
Figure 4 : Distribution du module de Young d’une BM pulmonaire murine reçue en suivant ce protocole. (A) Histogramme normalisé logarithmiquement des valeurs du module de Young de la BM résultante (N = 325). En ajustant une distribution normale (ligne continue noire), la valeur moyenne μ = 9,31 avec un écart type de σ = 0,18 est déterminée. Après retransformation, cela correspond à un module de Young de la BM de EBM = 11,05 kPa avec un intervalle d’écart-type asymétrique de [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. (B) QQ Tracé des quantiles des valeurs du module de Young BM logarithmisé en fonction des quantiles d’une distribution normale standard. Ce graphique montre qu’à l’exception de certaines valeurs dans les extrémités gauche et droite de la distribution, les valeurs du module de Young résultantes sont principalement distribuées log-normales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Extraction du module de Young des membranes basales pulmonaires murines natives à partir de cartes de force dérivées de la microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows the characterization of the mechanical properties of a sample with a spatial resolution of several tens of ...

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