Génération de sphéroïdes/organoïdes tridimensionnels à partir de cultures cellulaires bidimensionnelles à l’aide d’un nouveau dispositif de tamponnage

L’objectif de notre recherche est d’établir un protocole efficace et reproductible pour la génération de cultures cellulaires tridimensionnelles à l’aide d’un système innovant de micropuits basé sur des étapes dans des moules d’agarose. Notre objectif est de répondre à la question de savoir comment créer un environnement simplifié et contrôlé qui favorise des cultures 3D uniformes et de haute qualité pour les tests de médicaments, l’ingénierie génétique et les applications connexes. Les progrès récents des systèmes de culture cellulaire 3D améliorent les interactions cellulaires et créent des environnements plus similaires à ceux des in vivo.

Cette approche améliore la formation d’organoïdes sphéroïdes, ce qui en fait un outil prometteur pour la recherche biomédicale. Les technologies actuelles pour la culture cellulaire 3D comprennent les gouttes suspendues, la culture cellulaire rotative, les plastiques à faible attache, les plaques à puits coniques, les échafaudages microporeux, les billes magnétiques et les hydrogels sans échafaudage. Ces méthodes permettent la formation de structures cellulaires 3D, chacune ayant ses propres avantages et limites.

Notre protocole relève le défi de générer des sphéroïdes et des organoïdes 3D uniformes avec une taille et une qualité constantes à grande échelle. Il résout les problèmes de viabilité et de densité cellulaire, les difficultés de gestion et l’instabilité pendant le processus, s’avérant une solution rentable et reproductible pour la recherche fiable sur les cultures cellulaires 3D. Nous nous engageons à poursuivre l’amélioration des outils de recherche, la génération d’organoïdes de sphéroïdes de cellules bêta productrices d’insuline pour l’analyse in vitro et l’encapsulation dans des biopolymères, visant la réversion du diabète de type I et la génération d’organoïdes de sphéroïdes à partir de cellules cancéreuses du sein humain triple négatives comme plateforme de dépistage de médicaments avant le traitement du patient.

Concevez le dispositif de tamponnage à l’aide du logiciel spécifié. Lavez le tampon sur mesure avec une éponge à poils doux et de l’eau distillée pour éliminer tout résidu. Exposez le tampon propre à la lumière ultraviolette pendant cinq à 10 minutes pour assurer la stérilité.

Pour préparer une solution d’agarose à 1 à 2 %, pesez la quantité requise de poudre d’agarose pure et dissolvez-la dans du PBS. Faites chauffer la solution au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute. Ensuite, pipetez environ trois millilitres de la solution d’agarose à 40 degrés Celsius dans chaque puits d’une plaque à six puits.

Placez le tampon au centre du puits et laissez l’agarose se solidifier pendant 5 à 10 minutes. Après la solidification, retirez le tampon avec de légers mouvements de va-et-vient pour libérer le vide sans endommager les micropuits. Lavez les micropuits trois fois avec du PBS pour éliminer les résidus.

Exposez la plaque à la lumière ultraviolette pendant 10 minutes pour éliminer la contamination microbienne. Ajoutez trois millilitres de milieu de culture dans chaque puits de la plaque à six puits et incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Pour obtenir une suspension homogène d’îlots pancréatiques porcins, ajoutez de la trypsine à une culture cellulaire bidimensionnelle pour dissocier les cellules.

Ensuite, comptez les cellules et ajustez la concentration pour obtenir le nombre souhaité de cellules par micropuits d’une plaque à six puits. Pipetez trois millilitres de suspension cellulaire sur les micropuits d’agarose et faites tourner la plaque pour assurer une distribution uniforme. Laissez les cellules se stabiliser par gravité pendant 10 à 15 minutes.

Ensuite, observez les cellules stabilisées au microscope. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Tous les deux à trois jours, remplacez 50 % du support ancien ou usagé par du milieu frais.

Poursuivez l’élevage jusqu’à ce que des structures compactes et tridimensionnelles soient complètement formées. Pour prélever des sphéroïdes ou des organoïdes, prélever le milieu de culture et, à l’aide d’une pointe de pipette coupée, prélever les structures tridimensionnelles par pipetage vigoureux. Des structures tridimensionnelles compactes ont été formées avec succès après 48 heures de culture dans des micropuits d’agarose, comme observé par agrégation cellulaire en fonction du temps.

Des structures tridimensionnelles viables ont été conservées lors de l’élimination des micropuits d’agarose, la coloration verte indiquant des cellules vivantes à l’intérieur des structures, confirmant ainsi la viabilité et la stabilité des cellules.