Anisotropie de fluorescence résolue dans le temps à partir de molécules uniques pour caractériser la flexibilité locale dans les biomolécules

Cette recherche vise à étudier la flexibilité locale et la dynamique des biomolécules au niveau de la molécule unique, en utilisant l’anisotropie de fluorescence résolue en temps en mode microscopie confocale. La détection et la localisation de molécules uniques ont permis d’observer des biomolécules, mais la capture de leur dynamique nécessite d’autres approches. Les méthodes de fluorescence résolues dans le temps aident à combler cette lacune.

Outils courants pour l’étude expérimentale de la dynamique biomoléculaire, y compris la frette à molécule unique et la RMN. Au niveau de la molécule unique, diverses analyses, processus, l’émission fluorescente photon par photon, notamment l’analyse résolue en temps et l’analyse de variance en rafale.

L’utilisation de plusieurs fluorophores pour les expériences smFRET peut introduire des complexités dans la conception expérimentale et dans la fabrication d’échantillons d’une qualité suffisante. L’utilisation d’un seul marqueur et l’anisotropie de fluorescence résout certaines de ces complexités.

Nous avons constaté que la forme monomère du domaine de la tête de fourche de la FoxP1 humaine se comporte comme une protéine désordonnée et augmente sa population de repliement lorsqu’elle se dimérise.

[Instructeur] Pour commencer, filtrez la solution tampon standard préparée à travers un filtre à pores de 0,22 micromètre. Filtrez ensuite le tampon standard à travers un filtre à charbon pour l’acquisition d’une seule molécule. Pour les sondes fluorescentes, préparez des aliquotes de petit volume du BODIPY Fluorescent Pro préparé. Pour l’étalonnage de la configuration résolue à polarisation, activez d’abord les canaux de détection parallèles et perpendiculaires et allumez le laser bleu. Assurez-vous que la puissance du laser est réglée sur 60 microwatts et ouvrez le panneau de contrôle du logiciel de comptage de photons uniques ou TCSPC corrélé dans le temps. Ensuite, mélangez un microlitre de 100 nanomolaires de Rhodamine 110 avec 49 microlitres d’eau distillée. Ajoutez une goutte de liquide d’immersion sur l’objectif du microscope. Placez la vitre de protection sur l’objectif du microscope et assurez-vous que la gouttelette d’eau est centrée sur la lentille. Ajoutez 50 microlitres de la solution diluée de Rhodamine 110 au centre du verre de protection pour les mesures d’étalonnage. Ajustez le plan de l’image pour qu’il soit à l’intérieur de la solution et au-dessus de la surface du verre. À l’aide du bouton de mise au point, localisez le deuxième point focal lumineux et ajustez-le sur 1 1/2 tour. Ouvrez maintenant le logiciel en mode Résolu dans le temps et cliquez sur le bouton START. Enregistrez le taux de comptage pendant 120 secondes. Pour les mesures de fond, ajoutez 50 microlitres d’eau distillée au centre du verre de couverture et répétez l’acquisition. Enregistrez le taux de comptage des photons pendant 300 secondes et enregistrez le fichier sous le nom water.ptu. Pour des mesures d’arrière-plan supplémentaires, ajoutez 50 microlitres de tampon standard au centre du verre de protection. Enregistrez le taux de comptage des photons pendant 300 secondes et enregistrez le fichier sous standard_buffer.ptu. Lancez maintenant le logiciel d’analyse Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL, et cliquez sur Confirmer la configuration dans la fenêtre automatique. Cliquez ensuite sur Obtenir les paramètres du fichier, puis sur OK. Pour sélectionner la mesure à analyser, cliquez sur Data Path Array et sélectionnez le jeu de données approprié. Chargez maintenant le fichier water.ptu de mesure de l’eau pour les tableaux, tels que Green Scatter, le fichier standard_buffer.ptu pour le fond vert et Rhodamine110.ptu pour le vert épais. sous les paramètres de sélection Molécule unique, cliquez sur Suivant, puis sur Ajuster pour ouvrir une nouvelle fenêtre contextuelle. Appuyez ensuite sur Seuil pour modifier l’heure d’arrivée des interphotons et choisissez l’heure de l’événement de la molécule unique pour l’heure d’arrivée moyenne des interphotons. Cliquez maintenant sur le nombre minimum pour définir le nombre minimum de photons par événement moléculaire. Cliquez sur Paramètres d’ajustement des couleurs pour ajuster la durée de vie initiale de la fluorescence du vert et des autres couleurs à l’aide des paramètres de décroissance de la fluorescence. Modifiez, invitez et retardez les valeurs en ajustant les valeurs de départ et de à et fermez la fenêtre contextuelle. Enfin, appuyez sur Enregistrer pour traiter les fichiers ASCII et les enregistrer dans le dossier sélectionné. Transférez un pré-inoculum d’Escherichia coli C41 dans 500 millilitres de milieu LB avec un antibiotique pré-ajouté à un rapport de dilution de 1:500. Mesurer l’absorbance de la culture à 600 nanomètres pour suivre la croissance de la culture. Lorsque la densité optique atteint entre 0,5 et 0,7, ajoutez IPTG à une concentration finale de 0,5 millimolaire pour induire l’expression des protéines, et incubez. Centrifuger les cellules bactériennes à 3 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius lorsque la culture atteint une densité optique de 1,4 à 1,6. Après avoir jeté le surnageant, conservez la pastille à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’utilisation. Ensuite, ajoutez 50 à 100 micromolaires de protéine FoxP1 à un excès molaire dix fois plus important de DTT ou de TCEP et incubez. Placez une colonne de dessalage-10 dans un tube à centrifuger de 50 millilitres à l’aide d’un adaptateur de colonne pour l’échange de tampon. Ajoutez cinq millilitres de tampon PBS dans la colonne pour l’équilibrage et centrifugez-la à 1 000 g pendant deux minutes. Transférez la colonne-10 dans un tube neuf de 50 millilitres et ajoutez deux millilitres de tampon PBS dans la colonne. Chargez maintenant 500 microlitres de protéine FoxP1 dans la colonne. Eluter la colonne en centrifugeant à 1 000 g pendant deux minutes pour recueillir la protéine purifiée. Transférez la protéine dans un filtre ultra-centrifuge de coupure de poids moléculaire de 10 kilodaltons. Après une centrifugation à 7 500 g pendant 10 minutes, recueillir l’éluat concentré. Mesurez la concentration en protéines. Ajoutez ensuite BODIPY et incubez à quatre degrés Celsius pendant deux heures sur un rotateur. Renouvellement de l’échange de tampon et de la concentration en protéines. Après avoir déterminé la concentration en protéines, mesurez le degré d’étiquetage à l’aide de la formule. Ajoutez 495 microlitres d’eau ultrapure et cinq microlitres de Tween 20 dans un puits d’une lame de chambre, et mélangez bien. Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, lavez doucement la chambre avec de l’eau ultra-pure deux fois et séchez-la. Pour corriger la fluorescence de fond, effectuez des mesures d’une solution tampon. Pour des expériences d’anisotropie de fluorescence à molécule unique sur FoxP1 monomère, ajoutez 100 BODIPY picomolaires marqués FoxP1 et 100 nanomolaires non marquées FoxP1 à 500 microlitres de tampon standard dans une lame de chambre. Commencez les mesures, et vérifiez dans le logiciel BIFL que le nombre de rafales enregistrées en 30 secondes est compris entre 60 et 90. Si l’échantillon est plus concentré, diluez-le jusqu’à ce que le nombre d’éclats se situe dans cette plage. Enfin, analysez les mesures. L’analyse de la durée de vie de l’anisotropie de fluorescence d’une molécule unique a révélé une distribution unique provenant de deux temps de corrélation de rotation distincts dans le domaine de liaison à l’ADN FoxP1, suggérant la coexistence d’ensembles structurels ordonnés et désordonnés. L’analyse de variance en rafale a identifié un sous-ensemble de molécules FoxP1 présentant une anisotropie élevée et des variantes en excès, suggérant la présence de changements conformationnels dynamiques. L’analyse de la distribution des photons a différencié les états monomères et dimériques de FoxP1, montrant des distributions d’anisotropie et des taux d’échange distincts. La dimérisation a influencé les mouvements locaux et globaux dans FoxP1, les mesures de variance excédentaire indiquant des changements anisotropes significatifs à des sites spécifiques marqués à la cystéine. L’analyse de l’anisotropie dynamique a révélé que FoxP1 subit un déploiement partiel lors de la dimérisation et de la liaison à l’ADN, modifiant la fraction des populations structurées et désordonnées.