Name: Anisotropie de fluorescence résolue dans le temps à partir de molécules uniques pour caractériser la flexibilité locale dans les biomolécules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Découvrez l'anisotropie de fluorescence résolue dans le temps pour caractériser la flexibilité locale des biomolécules au niveau moléculaire unique. Cette méthode révèle la dynamique structurale des protéines comme FoxP1.

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<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>A20100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100</td></tr><tr><td>Filtre ultra centrifuge Amicon, 10 kDa MWCO</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010</td></tr><tr><td>Ampicilline sel sodique</td><td>Millipore Sigma</td><td>A0166-5G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166</td></tr><tr><td>BODIP FL Maléimide (BODIPY FL N-(2-Aminoéthyl))Maléimide)</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>B10250</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250</td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage jetables 10</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-0851-01</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>10197777001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro</td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrus</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>D12345</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Millipore Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001</td></tr><tr><td>E. coli cellules bactériennes C41</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, colonne de 5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>12004037</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Millipore Sigma</td><td>288-32-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6758-1G</td><td>Filtre à</td></tr><tr><td>membrane https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758 MCE, 0,22 &mu ; m Taille des pores</td><td>Millipore Sigma</td><td>GSWP02500</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Système de lames de chambre</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>154534</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534</td></tr><tr><td>OverExpress C41(DE3) Chimiquement Cellules Compétentes</td><td>Millipore Sigma</td><td>CMC0017-20X40UL</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>329-98-6</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830</td></tr><tr><td>Rhodamine 110</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>419075000</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasique</td><td>Millipore Sigma</td><td>7558-79-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264</td></tr><tr><td>Phosphate monobasique de sodium dihydraté</td><td>Millipore Sigma</td><td>13472-35-0</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505</td></tr><tr><td>TCEP, chlorhydrate, réactif</td><td>Millipore Sigma</td><td>580567-5GM</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>11332465001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001</td></tr></tbody></table>

anisotropie de fluorescence résolue dans le temps à partir de molécules uniques pour caractériser la flexibilité locale dans les biomolécules

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

Anisotropie de fluorescence résolue dans le temps à partir de molécules uniques pour caractériser la flexibilité locale dans les biomolécules

We describe a protocol for conducting time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level using confocal microscopy to investigate the ...

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Nous allons décrire une méthode qui mesure la cinétique de transport des ions des protéines membranaires spécifiques au site aux côtés de l'analyse des changements conformationnels à l'aide de fluorescence sur des cellules individuelles. Cette technique est adaptable aux canaux ioniques, les transporteurs et les pompes ioniques et peut être utilisé pour déterminer les contraintes distance entre sous-unités protéiques.

L&#39;examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

Les interactions protéiques sont au cœur de la fonction d'une cellule. techniques calorimétriques et spectroscopiques sont couramment utilisés pour les caractériser. Nous décrivons ici anisotropie de fluorescence comme un outil pour étudier l'interaction entre la protéine mutée dans le syndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) et le facteur Allongement-like 1 GTPase (EFL1).

Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine

Nous présentons la configuration et la procédure expérimentale pour obtenir des données smFRET à partir de grands réseaux donneurs-accepteurs avec un microscope TIRF. L’analyse étape par étape de ces mesures avec le logiciel d’inférence bayésienne Fast-NPS permet d’obtenir des informations structurelles à haute résolution grâce à l’application de modèles de colorants adaptés.

Information sur la structure à partir d&#39;une seule molécule FRET expériences utilisant la Nano-positionnement Système rapide

Un protocole pour les expériences FRET de haute précision au niveau de la molécule unique est présenté ici. En outre, cette méthodologie peut être utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). La détermination de distances précises est la première étape vers la construction de modèles structurels basés sur des expériences FRET.

FRET de haute précision au niveau d&#39;une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir des données de trois couleurs smFRET et son analyse avec un ensemble 3D modèle de Markov caché. Avec cette approche, les scientifiques peuvent extraire informations cinétiques systèmes complexe des protéines, y compris coopérativité ou interactions corrélées.

À l’aide de trois couleurs frette de molécules simples pour étudier la corrélation des Interactions de protéine

Présenté ici est un protocole pour effectuer un transfert d'énergie de résonance de résonance de F'rster à l'étude de la résolution de HJ. L'excitation alternée bicolore est utilisée pour déterminer les constantes de dissociation. Un seul temps de temps smFRET est ensuite appliqué dans les essais de clivage en temps réel pour obtenir la distribution de temps d'arrêt avant la résolution HJ.

Méthodes de transfert d'énergie par résonance à molécule unique pour l'étude en temps réel de la résolution de jonction Holliday par GEN1

Cet article fournit des instructions étape par étape pour effectuer des mesures FRET précises entièrement corrigées sur des biomolécules individuelles à diffusion libre à l’aide de la smfBox open source et peu coûteuse, de l’allumage à la collecte et à l’analyse de données, en passant par l’alignement et la mise au point.

Effectuer des mesures FRET à molécule unique précises et précises à l’aide de la smfBox open source

L’amélioration de la fluorescence induite par une seule molécule résolue dans le temps est un capteur de proximité spectroscopique de fluorescence utile sensible aux changements structurels locaux dans les protéines. Ici, nous montrons qu’il peut être utilisé pour découvrir des conformations locales stables dans la α-synucléine, qui est également connue sous le nom de non structurée globulaire et instable lorsqu’elle est mesurée à l’aide de la règle FRET à plus longue portée.

Utilisation de l’amélioration de la fluorescence induite par les protéines résolues dans le temps pour identifier les conformations locales stables un α-synucléine à la fois

Nous présentons un protocole expérimental et un flux de travail d’analyse de données pour effectuer une spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore (FCCS) de cellules vivantes combinée à un transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) pour étudier la dynamique des récepteurs membranaires dans les cellules vivantes à l’aide de techniques modernes de marquage par fluorescence.

Spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence bicolore pour étudier l’interaction protéine-protéine et la dynamique des protéines dans les cellules vivantes

Cet article présente une méthode d’analyse spatio-temporelle de sondes mobiles à transfert d’énergie de résonance de Förster (smFRET) à molécule unique utilisant la microscopie à fluorescence à grand champ. La boîte à outils logicielle nouvellement développée permet de déterminer les traces temporelles smFRET des sondes en mouvement, y compris l’efficacité FRET correcte et les positions moléculaires, en tant que fonctions du temps.

Analyse spatio-temporelle bidimensionnelle automatisée de sondes FRET mobiles à molécule unique

Cette étude présente une procédure détaillée pour effectuer des expériences de transfert d’énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) sur des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) en utilisant un marquage spécifique au site via l’incorporation d’acides aminés non naturels (UAA). Le protocole fournit un guide étape par étape pour la préparation des échantillons smFRET, les expériences et l’analyse des données.

Visualisation de la dynamique conformationnelle des récepteurs membranaires à l’aide d’une seule molécule FRET

Découvrez l'anisotropie de fluorescence résolue dans le temps pour caractériser la flexibilité locale des biomolécules au niveau moléculaire unique. Cette méthode révèle la dynamique structurale des protéines comme FoxP1.

Anisotropie de fluorescence résolue dans le temps à partir de molécules uniques pour caractériser la flexibilité locale dans les biomolécules (Vidéo) | JoVE Journal

Anisotropie de fluorescence résolue dans le temps à partir de molécules uniques pour caractériser la flexibilité locale dans les biomolécules

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