L’isolement et la caractérisation des neutrophiles de basse et de densité normale dans le sang total

Notre recherche vise à comprendre le rôle des sous-ensembles de neutrophiles et comment ils contribuent à la pathogenèse de maladies inflammatoires telles que le lupus. Dans un sens plus large, nos travaux démontrent également l’hétérogénéité des populations de neutrophiles en biologie humaine et comment celle-ci peut changer en fonction de divers états physiologiques. De nouvelles recherches montrent que les populations de neutrophiles chez l’homme sont hétérogènes.

Cependant, les neutrophiles continuent d’être étudiés en tant que population unique en raison de la difficulté d’isoler les sous-types de manière fiable, sans activation et en quantité suffisante. Notre protocole fournit une méthode d’isolement intact et de caractérisation de base des sous-types de neutrophiles, surmontant ainsi ces problèmes. Des recherches récentes, bien que limitées, ont montré que les sous-types de neutrophiles, tels que les neutrophiles de basse densité, jouent un rôle dans les états physiologiques modifiés tels que la grossesse et l’inflammation, ainsi que dans des maladies comme la tuberculose, l’auto-immunité et le cancer.

Notre protocole permettra des recherches reproductibles et robustes sur les contributions de ces cellules à la santé et à la maladie humaines. Maintenant que nous disposons d’un protocole robuste testé pour séparer les neutrophiles de faible densité des neutrophiles de densité normale, nous nous concentrons sur la réponse aux questions fondamentales relatives à la façon dont ces neutrophiles de faible densité se présentent dans des conditions inflammatoires. Nous nous intéressons particulièrement à la façon dont ceux-ci sont différents des neutrophiles de densité normale dans leur nombre de cellules, leur immunophénotype, leur immunométabolisme, etc.

Pour commencer, étiquetez quatre tubes coniques de 50 millilitres pour des solutions de travail isotoniques de 100 %81 %70 % et 55 %Ajoutez 27 millilitres de milieu à gradient de densité au premier tube étiqueté 100 %Ajoutez 3 millilitres de 10X PBS. Ensuite, mesurez les volumes requis de solutions isotoniques 100 % fonctionnelles et 1X PBS pour chaque concentration de solutions de travail. Ajoutez-le dans les tubes coniques respectifs.

Utilisez une pipette Pasteur pour bien mélanger pour assurer l’homogénéité. Maintenant, superposez soigneusement 3 millilitres de la solution isotonique à 81 % au fond d’un tube conique de 15 millilitres. Ensuite, superposez lentement et doucement 3 millilitres de la solution isotonique à 70 %, en veillant à ce que les couches ne se mélangent pas.

Pour préparer le tampon de séparation cellulaire, combinez 2 % de sérum de veau fœtal, 1 millimole d’EDTA et de PBS pour obtenir un volume total de 500 millilitres. Pipette pour bien mélanger pour l’uniformité. Agitez soigneusement les billes magnétiques pendant 30 secondes pour vous assurer qu’elles sont complètement remises en suspension avant utilisation.

Pour chaque donneur, aliquote 4 millilitres de sang total dans trois tubes à fond rond distincts de 14 millilitres. Pipette 200 microlitres de cocktail d’isolement des neutrophiles et 200 microlitres de billes magnétiques dans chaque tube. Pipetez doucement la solution pour remettre le mélange en suspension avant l’incubation afin de permettre aux réactifs de se lier aux cellules indésirables.

Ensuite, ajoutez le tampon de séparation cellulaire dans chaque tube pour porter le volume à 12 millilitres et mélangez bien. Placez les tubes sans couvercle sur une grille magnétique et incubez. À l’aide d’une pipette sérologique, transférez avec précaution la suspension de cellules transparentes contenant des neutrophiles de chaque tube dans un nouveau tube propre.

Retirez ensuite le tube d’origine de l’aimant. Faites de nouveau vortex les perles magnétiques pendant 30 secondes. Ajoutez 200 microlitres de billes magnétiques à la suspension cellulaire nouvellement transférée avant la remise en suspension et l’incubation, comme démontré précédemment.

Replacez les tubes sur l’aimant sans couvercles. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, transférez la suspension à cellules transparentes contenant des neutrophiles isolés dans un nouveau tube. Tirez les suspensions de neutrophiles isolées obtenues à partir de sang total dans un seul tube de 50 millilitres.

Remplissez le tube jusqu’à un volume total de 50 millilitres à l’aide du tampon de séparation des cellules. Centrifugez avec la pause, puis jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de neutrophiles dans 1 millilitre de tampon de séparation cellulaire. Après avoir centrifugé à nouveau la suspension, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de neutrophiles dans 3 millilitres du milieu à gradient de densité de 55 %.

Superposez lentement les 3 millilitres de milieu à gradient de densité de 55 % contenant la suspension cellulaire sur les tubes de gradient de densité préfabriqués, en évitant de perturber le gradient. Centrifugez les tubes à 720 G pendant 30 minutes sans utiliser la pause. Après la centrifugation, manipulez les tubes avec précaution pour ne pas perturber les couches.

À l’aide d’une pipette de transfert, isolez soigneusement les couches séparées contenant des neutrophiles de densité faible et normale et transférez-les dans des tubes de 15 millilitres étiquetés séparément. Pour éliminer tout milieu à gradient de densité résiduel, ajoutez du PBS dans chaque tube de 15 millilitres jusqu’à 15 millilitres. Ensuite, centrifugez à 400 G pendant 5 minutes à température ambiante avec la pause activée.

Comptez les cellules de chaque fraction sur un hémocytomètre avant de poursuivre l’expérience. La superposition de neutrophiles totaux sur le milieu du gradient de densité a permis de former avec succès deux bandes distinctes. Les neutrophiles de faible densité formant une bande supérieure et les neutrophiles de densité normale formant une bande inférieure.

La surcharge du milieu à gradient de densité avec des neutrophiles supérieurs à 5-6 millions de cellules par millilitre a fait apparaître les bandes diffuses, augmentant le risque de mélange de sous-types. La pureté moyenne d’isolement était de 93,8 % pour les neutrophiles de faible densité et de 96,3 % pour les neutrophiles de densité normale avec une contamination minimale par d’autres types de cellules.