Protocole d’injection directe du nerf vague pour les rats

Nous menons des études précliniques en thérapie génique substitutive. Nous utilisons des animaux de laboratoire pour établir la méthode optimale d’administration des médicaments afin de résoudre les problèmes des systèmes nerveux autonomes et périphériques. La thérapie génique par vecteur est l’une des technologies émergentes de la thérapie génique. L’application d’un vecteur viral associé à l’adino est l’une des options potentielles disponibles actuellement. L’AAV9 a été largement utilisé dans la recherche en thérapie génique pour délivrer le gène d’intérêt dans le système nerveux central et périphérique. Les chercheurs n’ont pas assez d’options pour administrer des agents médicamenteux directement dans le système nerveux périphérique. Il existe des situations qui impliquent des troubles neurologiques causés par le système nerveux périphérique ou autonome. Cependant, il n’existe pas de méthode efficace d’administration de médicaments pour remédier à ces situations.

Cette méthode démontre un moyen d’administrer les agents médicamenteux directement dans les nerfs vagues pour résoudre le problème du système nerveux autonome dans les études précliniques utilisant des rats. De plus, cette méthode peut être exportée pour administrer des médicaments à travers d’autres nerfs périphériques avec les modifications nécessaires chez d’autres espèces. Le laboratoire gris poursuivra la recherche préclinique sur la thérapie génique médiée par AV en utilisant à la fois des rongeurs et de grands animaux. De plus, nous nous sommes concentrés sur le développement de nouvelles méthodes applicables pour ouvrir la voie à la stratégie de la thérapie de remplacement génique.

[Narrateur] Pour commencer, connectez une seringue en verre de 100 microlitres avec le piston retiré à une aiguille de calibre 27. Connectez une extrémité d’environ 45 centimètres de tube en polyéthylène stérilisé à l’aiguille de calibre 27, puis ajustez une seringue en plastique de trois millilitres avec une aiguille de calibre 27 et chargez la seringue avec environ 0,5 millilitre de solution saline normale à 0,9 %. Utilisez la solution saline normale à 0,9 % pour remplir le tube en polyéthylène par l’extrémité ouverte, en veillant à ce que toute la longueur du tube et le corps de la seringue en verre soient remplis jusqu’à ce que la solution saline déborde. Une fois cela fait, retirez et jetez la seringue de trois millilitres et son aiguille. Insérez maintenant le piston dans le corps de la seringue en verre, poussez-le légèrement vers l’avant jusqu’au milieu du cylindre, puis placez la seringue en verre dans le pousse-seringue. Utilisez le pousse-seringue pour tirer légèrement le piston vers l’arrière, créant un espace d’air d’environ 1,5 centimètre à l’extrémité ouverte du tube. Pipeter au moins cinq microlitres de colorant et un mélange de médicament candidat à l’aide d’une micropipette de 10 microlitres sur un morceau de film para stérilisé. Prélevez le mélange de médicament candidat dans la tubulure à l’aide du pousse-seringue et marquez le niveau du mélange d’injection avec un marqueur. Fixez une aiguille de calibre 35 à la tubulure et fixez-la à une surface propre sur la scène chirurgicale avec du ruban adhésif, en vous assurant qu’elle reste fixe, stérilisée et ne touche rien d’autre. Démarrez le pousse-seringue pendant 10 à 15 secondes jusqu’à ce que la solution d’injection commence à sortir de la pointe de l’aiguille. Transférez le rat anesthésié sur une table équipée pour l’épilation et la préparation du site. Appliquez une pommade artificielle lacrymogène dans les deux yeux du rat pour prévenir une sécheresse excessive. Administrer des analgésiques selon le protocole approuvé de l’animal de l’établissement pour contrôler la douleur lorsque le rat reprend conscience. Rase la face ventrale du cou au niveau de la région cervicale et l’étendre jusqu’à environ deux centimètres perpendiculairement à la ligne médiane des deux côtés, du menton au sternum. Stérilisez la zone rasée trois fois avec de l’alcool éthylique à 70 % et de la bétadine à 10 %, en essuyant vers l’extérieur selon un motif circulaire. Transférez le rat au stade chirurgical en position couchée sous le microscope de dissection. Assurez-vous que le coussin chauffant sous le rat est correctement tempéré et ajustez les microscopes focalisés pour visualiser la région cervicale pour la chirurgie. Accrochez les rats ou les dents de la mâchoire avec une suture non résorbable. Fixez l’extrémité ouverte de la suture à l’intérieur du cône nasal pour garder les narines à l’intérieur du cône nasal tout au long de l’anesthésie. Positionnez le rat de manière à ce que sa tête repose sur le côté gauche du chirurgien droitier. Placez un coussin de gaze stérilisée sous le cou pour aligner et redresser la région cervicale. Couvrez le corps du rat avec un champ stérilisé en laissant la zone chirurgicale exposée. Fixez quatre goupilles d’écarteur avec des fixateurs magnétiques aux quatre coins de la scène chirurgicale. Maintenant, injectez des anesthésiques locaux épidermiques sur la ligne médiane de la région cervicale où l’incision sera faite. À l’aide d’une lame de scalpel, faites une incision cutanée longitudinale de deux centimètres sur la ligne médiane entre le menton et le sternum dans la région cervicale ventrale. Ensuite, avec des embouts en coton stérilisé, le blunt sépare les bords de la peau coupée. À l’aide des pointes de l’écarteur, rétractez les bords de peau séparés dans des directions opposées. Séparez le fascia à l’aide d’embouts en coton pour aller plus profondément et poussez les glandes salivaires latéralement. Maintenant, séparez les muscles mastoïdiens du sternum avec des embouts en coton et rétractez-les latéralement avec des goupilles d’écartement. Continuez à séparer le tissu du côté gauche de la trachée jusqu’à ce que la gaine carotide soit visible. Utilisez des pinces fines pour créer un petit trou dans la gaine carotide sans endommager l’artère carotide, et séparez soigneusement le nerf vague gauche de l’artère carotide commune. Une fois que le nerf est séparé de l’artère à l’aide d’une pince, utilisez une aiguille incurvée de calibre 25 ajustée à une seringue d’un millilitre pour accrocher et tenez le nerf avec la main non dominante. Tenez l’aiguille chargée avec le mélange de colorant candidat avec la main dominante. Pour faciliter une piqûre en douceur, gardez le nerf droit en le tirant doucement à l’aide du crochet de calibre 25. insérez l’aiguille dans le nerf et avancez-la de plus de 0,5 centimètre tout en gardant l’aiguille parallèle au nerf vague. Tirez légèrement vers l’arrière pour qu’environ 0,4 à 0,5 centimètre de l’aiguille reste à l’intérieur du nerf. Limitez le nombre de piqûres nerveuses avec une seule aiguille à un maximum de trois. Après avoir confirmé l’insertion de l’aiguille, maintenez sa position sans bouger et allumez le pousse-seringue. Surveillez la perfusion pour vous assurer qu’elle reste à l’intérieur du nerf et qu’elle s’écoule correctement. Utilisez le point marqué sur le tube de perfusion pour suivre le mouvement du mélange de colorant médicamenteux. Observez lorsque le nerf commence à développer la couleur du colorant. Retirez l’aiguille incurvée de calibre 25 et, à l’aide d’embouts en coton stériles, ramenez doucement les tissus dans leur position d’origine. Retirez ensuite les embouts de l’écarteur. Fermez la plaie avec une suture résorbable ou non résorbable et appliquez une petite quantité de colle tissulaire entre les points de suture si nécessaire pour vous assurer que la plaie se ferme parfaitement.