Méthode nouvelle et efficace pour la coloration par fluorescence du cœur de la drosophile avec cryosectionnement

Mon laboratoire de recherche utilise le modèle de la drosophile pour étudier le vieillissement et les troubles métaboliques, en explorant l’alimentation et l’exercice limités dans le temps comme intervention pour le métabolisme, le muscle cardiaque, le sommeil et d’autres maladies du vieillissement. L’apprentissage automatique et l’omique avec une stratégie physiologique, génétique et nutritionnelle rationalisent le dosage de la drosophile à l’aide de dispositifs imprimés en 3D et d’approches d’apprentissage automatique. L’immunohistochimie fluorescente des cœurs de drosophile permet la détection de plusieurs protéines à travers les génotypes et les âges, mais est confrontée à des défis tels que des dissections complexes, la préservation des tissus et l’imagerie à haute résolution d’un modèle d’expression protéique spécifique.

Ce protocole améliore la préservation des tissus, la pénétration des anticorps et la résolution de l’imagerie, ce qui permet de mieux visualiser les marqueurs protéiques cardiaques. Il relève des défis tels que la dissection complexe, les lésions tissulaires et la résolution limitée dans la méthode traditionnelle de montage du cœur entier. Ce protocole améliore l’accessibilité de la recherche sur le cœur de la drosophile en éliminant la dissection complexe, en permettant une exécution d’une seule main et en évitant la microscopie confocale coûteuse, ce qui rend l’imagerie à haute résolution plus réalisable.

Pour commencer, anesthésez 5 à 10 mouches à l’aide d’un tapis anti-mouches au dioxyde de carbone. Positionnez les mouches visibles au microscope à un grossissement de 1X à 2X. À l’aide de ciseaux à ressort, décapitez les mouches, coupez les ailes et retirez les pattes.

Conservez le thorax et l’abdomen ensemble, appelés le corps. À l’aide d’un pinceau, placez délicatement les corps dans des tubes de 1,5 millilitre étiquetés sur de la glace jusqu’à ce que tous les groupes expérimentaux aient été recueillis. Après avoir retiré les tubes de la glace, ajoutez 100 microlitres d’acide tétraacétique éthylène glycol de 10 millimolaires à pH 8 dans chaque tube.

Assurez-vous que tous les corps sont immergés et placez les tubes sur un agitateur orbital pendant 10 minutes. Ensuite, retirez et jetez la solution d’acide tétraacétique d’éthylène glycol des tubes. Pipetez 100 microlitres de PBS dans chaque tube pour laver le tissu pendant 10 minutes.

Placez les tubes sur l’agitateur orbital pendant le processus de lavage. Après avoir jeté le PBS, pipetez 100 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans une solution de PBS dans chaque tube. Placez les tubes sur un agitateur orbital à 100 unités pendant 15 minutes, en vous assurant que les tissus restent en contact avec la solution.

Ensuite, jetez la solution de paraformaldéhyde. Une fois le lavage final terminé, transférez les corps dans une solution de 10 % de saccharose dans du PBS. Assurez-vous que les corps sont en contact avec la solution à l’intérieur du tube.

Récupérez la glace sèche de l’entrepôt et sélectionnez-en quelques morceaux pour les placer dans un petit plateau en métal ou en plastique. Choisissez un plateau dont les dimensions permettent d’insérer le moule et placez-le directement sur un seul gros morceau de glace carbonique plat. Remplissez un moule étiqueté à 50 % avec une température de coupe optimale, ou composé OCT, en versant lentement pour minimiser les bulles.

À l’aide d’un pinceau, placez soigneusement les corps de drosophile disséqués et fixés à la surface du composé OCT à l’intérieur du moule. À l’aide d’une pince, poussez chaque corps vers le bas du moule avec la paroi dorsale du thorax et de l’abdomen généralement alignée le long du bas. Ajustez les corps de manière à ce que l’abdomen repose à plat le long du fond du moule.

Alignez tous les corps dans les dimensions X, Y et Z pour vous assurer que chaque section inclura tous les sujets simultanément. Corrigez la courbure de l’abdomen, surtout chez les mâles, pour l’aplatir autant que possible sans percer ni écraser les corps. Une fois que tous les sujets sont en place, positionnez le moule de manière à ce que le fond repose directement sur un morceau de glace sèche.

Assurez-vous que le composé OCT commence à geler au contact et continuez jusqu’à ce que tous les sujets soient complètement enfermés dans le moule. Après la congélation, transférez le moule dans un congélateur réglé à moins 20 degrés Celsius pour permettre une congélation complète. Une fois complètement congelé, remplissez la partie restante du moule avec du composé OCT.

Pour fixer un mandrin au moule, appliquez une quantité généreuse de composé OCT sur le bloc. Appuyez sur le foret à plat sur le composé et laissez-le geler complètement dans le cryostat, généralement en cinq minutes. Libérez ensuite le mors de mandrin et le bloc OCT du moule.

Placez le foret dans le mandrin, en vous assurant que le bloc reste correctement orienté de haut en bas et serrez la clé du mandrin pour fixer le foret. Maintenant, à l’aide des boutons de réglage et des commandes de profondeur du mandrin, alignez le bloc avec la lame et réglez la largeur de section sur 20 micromètres ou moins. Coupez chaque tranche du bloc en utilisant un mouvement lent mais constant, permettant au verre anti-roulis de capturer chaque tranche au fur et à mesure qu’elle est coupée.

Collectez les sections à l’aide de diapositives réchauffées. À l’aide d’une lame de rasoir, retirez l’excès de composé OCT entourant les sections. Tracez le contour de chaque lame à l’aide d’un marqueur hydrophobe pour garder les solutions de lavage et de coloration confinées au tissu.

À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, lavez les lames trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune sans toucher le tissu. Après avoir jeté le lavage final, pipetez la solution de coloration fluorescente sur les mouchoirs et incubez pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, jetez la teinture fluorescente et lavez les lames trois fois pendant cinq minutes chacune avec du PBS.

Ensuite, jetez le dernier lavage PBS, en laissant une petite quantité de solution sur la lame. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, pipetez trois à cinq gouttes de support de montage sur la lame, en évitant l’application directe sur le tissu. À l’aide d’une pince, positionnez la lamelle sur un bord et abaissez progressivement l’autre côté jusqu’à ce qu’elle affleure la glissière.

Scellez les lames avec du vernis à ongles sans néon ni paillettes. Si le support de montage ne durcit pas, en fonction de la coloration fluorescente, imagez immédiatement ou stockez les lames pour plus tard. Avant l’imagerie, inspectez la propreté des lames et nettoyez-les délicatement à l’aide d’une lingette en papier avec une solution d’éthanol à 70 % dans de l’eau.

Analysez les sujets fluorescents les plus brillants de l’expérience afin de sélectionner les temps d’exposition appropriés pour chaque canal de fluorescence. Examinez chaque groupe expérimental dans une vue en direct pour toutes les chaînes afin de confirmer les paramètres d’exposition corrects. Pour plus de cohérence, faites la mise au point sur chaque sujet en utilisant le même canal de fluorescence et capturez des images pour tous les sujets.

Après l’imagerie, stockez les lames dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pour une capture d’image future. La méthode d’imagerie par fluorescence a préservé les caractéristiques clés du cœur de la drosophile, telles que l’ostium, la valve, les fibres longitudinales et les fibres circonférentielles. L’ensemble de la structure du tube cardiaque et les structures mineures détaillées ont été capturés à différents grossissements, avec 10X pour la structure entière et des grossissements de 40X à 60X montrant des détails plus fins, tels que des fibres contractiles circonférentielles et des fibres stabilisatrices longitudinales.

Des micrographies à fluorescence représentatives ont montré des structures cardiaques préservées chez la drosophile w1118 avec des noyaux colorés au DAPI, des lipides colorés en vert et des myofibrilles contenant de l’actine colorées en rouge avec de la phalloïdine. La coloration à la phalloïdine a efficacement mis en évidence les fibres longitudinales et circonférentielles, démontrant la structure préservée des filaments d’actine malgré les contraintes de gel et de sectionnement. La coloration des taches lipidiques a révélé un stockage de graisse localisé près du tube cardiaque.