Développement et évaluation de modèles d’infection intracellulaire pour Staphylococcus aureus

Nos recherches portent sur les infections à staphylocoque doré dans le but d’établir un modèle d’infection intercellulaire. Ce modèle fournira des informations précieuses sur le mécanisme sous-jacent aux infections intercellulaires et contribuera à l’élaboration d’un âge strict pour leur prévention et leur traitement. Les derniers progrès dans l’infection intracellulaire à staphylocoque doré consistent à étudier le mécanisme d’infection pour réguler la survie et la propagation des bactéries dans la cellule, et à optimiser le médicament et la modification structurelle pour améliorer l’effet thérapeutique.

Ces domaines de recherche utilisent la culture cellulaire, la technologie de séquençage cellulaire émergente, l’oxythermie à haut combustible, la technologie d’édition de gènes et d’autres technologies connexes pour étudier l’infection bactérienne dans les cellules. Contrairement aux modèles d’infection traditionnels, nous avons affiné les conditions expérimentales spécifiques aux infections intracellulaires. Après avoir infecté les cellules avec le staphylocoque doré individuellement, les cellules infectées par la bactérie sont ensuite inoculées à des souris pour établir des infections intracellulaires.

Cette approche améliore l’efficacité en minimisant l’interférence des bactéries libres, assurant une rétention plus précise du processus d’infection intracellulaire. Notre méthode se concentrera sur le développement de médicaments à base d’anticorps et progressera dans la prévention et le traitement des infections bactériennes à l’avenir. Pour préparer un bouillon à 6 % d’amidon, ajoutez successivement de la poudre d’extrait de bœuf, du tryptone et du chlorure de sodium dans un récipient en verre dans un rapport massique de 3 à 10 à 5.

Ajoutez 100 millilitres d’eau distillée double et remuez pour dissoudre les composants. Faites chauffer la solution au micro-ondes. Ensuite, ajoutez de l’amidon soluble dans un rapport massique de 6 et remuez le mélange jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous.

Autoclavez le bouillon à 121 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois stérilisé, conservez le bouillon à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il forme une pâte. Pour collecter les macrophages péritonéaux de la souris, à l’aide de la main gauche, saisissez le cou de la souris et contrôlez sa queue.

Ensuite, retournez la souris de manière à ce que sa tête soit positionnée vers le bas et que son abdomen soit tourné vers le haut. Administrer une injection intrapéritonéale de trois millilitres de bouillon d’amidon à 6 % chez la souris. Après 72 heures d’injection, sacrifiez la souris anesthésiée et désinfectez-la avec de l’alcool éthylique à 75 %.

À l’aide de ciseaux ophtalmiques, ouvrez l’abdomen de la souris pour exposer complètement le péritoine. Injectez 10 millilitres de DMEM dans la cavité abdominale par injection intrapéritonéale. Frottez doucement l’abdomen pendant une minute pour laver la cavité.

Ensuite, à l’aide d’une seringue, recueillez le liquide lavé dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifugez le liquide de lavage à 300 G pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de DMEM complété par 10 % de FBS, de la pénicilline et de la streptomycine.

Prenez 10 microlitres de suspension cellulaire et ajoutez-le au compteur de cellules pour compter les cellules. Diluez les cellules à une concentration de 2 fois 10 à la puissance 6 cellules par millilitre avec DMEM FBS. Déposer un millilitre de suspension cellulaire par puits sur une plaque à six puits.

Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures. Après l’incubation, retirer le surnageant. Lavez les cellules deux fois avec du PBS stérile et cultivez-les pendant la nuit avec un millilitre de DMEM par puits dans les mêmes conditions.

Incuber les macrophages péritonéaux avec le staphylocoque doré SARM-252 pendant deux heures. Retirez le surnageant et lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ajoutez un millilitre par puits de milieu DMEM complet contenant 100 microgrammes par millilitre de gentamicine et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone.

Après l’incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS. À l’aide d’un grattoir cellulaire, collectez les macrophages péritonéaux dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres. Centrifuger les échantillons à 1000 G pendant cinq minutes.

Ajoutez 10 microgrammes par millilitre de lysozyme aux macrophages infectés par le SARM-252 intracellulaire et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir lavé les cellules deux fois avec du PBS, mettez-les à nouveau en suspension dans un millilitre de PBS. Ensuite, prélevez environ 20 microlitres d’aliquote et ajoutez 0,1 % de Triton X-100 pendant cinq minutes pour lyser les cellules.

Effectuez des dilutions en série de la suspension de cellules lysées avec du PBS et déposez-les sur une plaque de tarière de soja tryptique. Incuber l’assiette toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, comptez les colonies bactériennes pour calculer la bactérie intracellulaire SARM-252 dans les macrophages péritonéaux.

Placez la souris sous une lampe de physiothérapie infrarouge jusqu’à ce que la veine de la queue soit dilatée. Divisez au hasard les souris en quatre groupes. Injecter par voie intraveineuse 3 fois 10 à la puissance 6 UFC de SARM planctonique 252 dans la veine caudale de la souris.

Après 24 heures, sacrifiez la souris anesthésiée et désinfectez-la soigneusement avec de l’alcool éthylique à 75 %. Utilisez une pince à épiler d’une main pour soulever la peau abdominale et de l’autre main, coupez la peau à l’aide de ciseaux ophtalmiques. Localisez les reins dans la cavité abdominale et dénudez-les soigneusement complètement.

Transférez les reins dans un tube de broyage contenant un millilitre de PBS et broyez-les jusqu’à ce qu’il ne reste plus de tissu solide. Versez le tissu homogénéisé dans le tube Eppendorf. Effectuer des dilutions en série de l’homogénat tissulaire à l’aide de PBS.

Placez chaque dilution sur des plaques de vis de soja triptyques séparées et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Comptez les colonies bactériennes le lendemain et analysez les données. Des modèles d’infection intracellulaire de S. aureus ont été établis avec succès dans des conditions de phagocytose optimisées et un traitement antibiotique prolongé, certaines bactéries survivant dans les macrophages.

Les macrophages infectés par S. aureus résistant à la méthicilline ont conservé des bactéries intracellulaires après deux heures de traitement antibiotique, lorsque le surnageant ne contenait plus de bactéries. In vivo, des tests de colonisation bactérienne chez la souris ont montré que la vancomycine éliminait S. aureus extracellulaire, mais n’a pas réussi à éliminer les bactéries intracellulaires.