Analyse de l’expression oncogène avec altérations du pH dans une lignée cellulaire canalaire pancréatique

Dans les hôpitaux AIG, nous étudions comment la diminution des sécrétions canalaires pancréatiques et la diminution du pH affectent l’expression des gènes dans les cellules canalaires pancréatiques, en nous concentrant particulièrement sur les oncogènes, en explorant la possibilité d’adaptation cellulaire aux microenvironnements acides. Le défi ici est l’hétérogénéité des tumeurs pancréatiques, ce qui complique le traitement ainsi que les approches expérimentales. Nous avons donc effectué une analyse RNAC des cellules canalaires pancréatiques dans des conditions de pH réduit, et nous avons constaté qu’il y a une expression accrue de trois oncogènes, mettant en évidence les liens potentiels entre l’environnement acide et l’expression des oncogènes dans les cellules canalaires pancréatiques.

Notre étude a mis en lumière l’expression de l’oncogène dans des conditions de pH réduit, et ce système peut faire progresser nos recherches dans l’étude de l’adénocarcinome canalaire pancréatique dans des conditions d’inflammation. La portée future de cette étude est donc d’évaluer le rôle de l’augmentation des expressions oncogènes dans l’initiation de tumeurs dans des conditions inflammatoires, telles que dans la pancréatite chronique. Pour commencer, procurez-vous la lignée cellulaire canalaire pancréatique normale humaine.

Décongelez les cellules à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Filtrez maintenant le milieu complet fraîchement préparé à travers un filtre à seringue. Ajoutez six millilitres de milieu complet à un nouveau tube conique de 15 millilitres.

Transférez ensuite la suspension cellulaire décongelée dans le tube et mélangez soigneusement. Centrifuger la suspension à 1 800 G pendant six minutes. Jetez le surnageant et ajoutez un millilitre de milieu de culture à la pastille avant de mélanger délicatement.

Ensuite, ajoutez quatre millilitres de milieu complet dans une boîte de Pétri de 60 millimètres. Ensuite, pipetez la suspension cellulaire dans le sens de la goutte dans le flacon. Incuber la culture à 37 degrés Celsius sous une supplémentation en dioxyde de carbone de 5 %.

Pour modifier le pH du milieu de culture, préparez d’abord 100 millilitres de solutions mères de phosphate de sodium de 0,5 molaire avec des valeurs de pH de 6,0, 6,5 et 7,0. Vérifiez le pH à l’aide d’un pH-mètre et ajustez-le à l’aide d’une molaire d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium molaire. Ensuite, filtrez, stérilisez les tampons dans une hotte à flux d’air laminaire à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micromètre.

Ensuite, ajoutez 20 millilitres de tampon stérile de phosphate de sodium de 0,5 molaire du pH respectif à 80 millilitres de milieu de culture pour préparer des milieux de pH différents. Ajoutez le milieu avec le pH modifié à 85 à 90 % de cellules canalaires pancréatiques humaines confluentes. Observez les changements morphologiques au microscope à fond clair à des intervalles d’une heure pendant six heures.

Pour isoler l’ARN de la culture, aspirez d’abord le milieu de culture et rincez les cellules avec un millilitre de PBS. Placez la parabole de 60 millimètres sur de la glace, puis un millilitre de PBS dans la parabole de 60 millimètres et grattez les cellules avec un grattoir à cellules. Transférez maintenant la suspension dans un nouveau tube.

Centrifugez-le à 8 000 G pendant 10 minutes et jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de tampon de lyse contenant du bêta-mercaptoéthanol à la pastille. Pipetez la suspension de haut en bas pendant cinq à 10 minutes sur de la glace.

Ajoutez un volume égal de 70 % d’éthanol au lysat et pipetez la suspension pour bien mélanger. Transférez la solution dans une colonne à membrane de silice. Ensuite, centrifugez la colonne à plus de 8 000 G pendant 30 secondes et jetez l’écoulement.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage à l’échantillon et centrifugez-le à nouveau. Centrifugez le tube vide pendant une minute à plus de 8 000 G.Enfin, ajoutez 30 à 50 microlitres d’eau sans nucléase dans la colonne. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, centrifugez à nouveau la colonne à des vitesses supérieures à 8 000 G pendant cinq minutes.

Une réduction significative de la taille des cellules et un rétrécissement des cellules ductiles en milieu acide ont été observés par rapport aux cellules maintenues dans un milieu normal. Les changements les plus prononcés dans la mort cellulaire se sont produits après six heures d’incubation, avec une diminution supplémentaire du nombre de cellules et des signes de stress cellulaire à 22 heures. Le nombre de gènes régulés à la hausse était le plus élevé à pH 6,5 avec 148 gènes, suivi du pH sept avec 109 gènes et du pH six avec 90 gènes.

Les gènes régulés à la baisse étaient moins nombreux, soit 20 à pH six, 14 à pH 6,5 et 23 à pH sept. Trois oncogènes, LCK, FGR et ASAP trois ont été régulés à la hausse à tous les niveaux de pH testés, suggérant un rôle dans la prolifération cellulaire dans des conditions acides.