Name: Isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Découvrez l'isolement d'adipocytes matures murins à partir de souris maigres et obèses par collageénase et DNase. Ce protocole évolutif permet l'analyse fonctionnelle de ces cellules fragiles pour étudier l'obésité et les maladies métaboliques.

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<meta charset="utf8"></head><body>Culture d’adipocytes et d’explants murins pour des études fonctionnelles et d’imagerie

<ol><li>Ward, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+U.S.+state-level+prevalence+of+adult+obesity+and+severe+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity.</a> N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Longo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+as+determinant+of+obesity-associated+metabolic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications.</a> Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+Adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Johnston, E. K., Abbott, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+paracrine-%2C+autocrine-%2C+and+matrix-dependent+signaling+during+the+development+and+progression+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity.</a> Cells. 12 (3), 407(2023).</li>
<li>Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+adipose+tissue+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction.</a> Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+and+lipidomic+profiling+of+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissues+in+15+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates.</a> Sci Data. 10 (1), 453(2023).</li>
<li>Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-to-breast+cancer+crosstalk%3A+Comprehensive+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights.</a> Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Nahmgoong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+properties+of+adipose+stem+cell+subpopulations+determine+fat+depot-specific+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics.</a> Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue at single-cell resolution.</a> Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+breast+tumorigenesis+through+taz-dependent+secretion+of+resistin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).</li>
<li>Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+liver-visceral+adipose+axis+during+hepatic+resection+and+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation.</a> Cells. 8 (9), 1100(2019).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-alpha-2-glycoprotein+secreted+by+triple-negative+breast+cancer+promotes+peritumoral+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis.</a> Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+repertoire+of+human+adipocyte+subtypes+develops+from+transcriptionally+distinct+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+human+white+adipocytes+cultured+under+membranes+maintain+identity%2C+function%2C+and+can+transdifferentiate+into+brown-like+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes.</a> Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).</li>
<li>Chaurasiya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+adipose+tissue+microvascular+endothelial+cell+isolation+and+establishment+of+co-culture+with+white+adipocytes+to+analyze+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication.</a> Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+pre-adipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice.</a> J Vis Exp. 167, e62005(2021).</li>
<li>Farrar, J. S., Martin, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+and+subsequent+differentiation+into+white+or+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes.</a> Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).</li>
<li>You, X., Gao, J., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+to+mechanically+isolate+stromal+vascular+fraction%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review.</a> Regen Ther. 27, 120-125 (2024).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+isolation+from+mouse+epididymal+adipose+tissue+and+sequencing+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).</li>
<li>Cho, D. S., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+adipose+progenitor+cells+from+mouse+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues.</a> J Vis Exp. 162, e61694(2020).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+human+adipose+tissue+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Next-generation human adipose tissue culture methods.</a> Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).</li>
<li>Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+mature+adipocytes+using+membrane+mature+adipocyte+aggregate+cultures+%28MAAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC).</a> J Vis Exp. 156, e60485(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Poloxamer 188 solution</td><td>Sigma</td><td>P5556-100mL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conique</td><td>Cellstar</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>21 G Aiguille</td><td>BD</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Seringue</td><td>BD 309646</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conique</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6,5 mm Transwell avec 0,4 &micro ; m Pore Polycarbonate Membrane Insert</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500gm</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Plasma Membrane Stains</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>CL 316243 sel disodique</td><td>Tocris</td><td>1499</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Poudre</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM no pheonol Red</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A56708-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td>1518848</tr><tr><td>Gel Loading Pipet Tip</td><td>Fisher scientific</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Supplément GlutaMAX Gibco</td><td></td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol Assay Kit</td><td>Abcam</td><td>AB133130</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma</td><td>83264-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>75004271</tr><tr><td>Hoechst 33342 Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Mini Shaker d’incubation</td><td>VWR</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection de microscope</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Espaceurs d’imagerie SecureSeal</td><td>Grace Biolabs</td><td>654006</td><td></td></tr><tr><td>Seive (passoire à cocktail à mailles fines SteeL)</td><td>OXO</td><td>3112000</td><td>https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html</td></tr></tbody></table>

isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

Comme le montre la figure 2, un hachage correct (figure 2B) et une digestion (figure 2C) sont importants pour l’isolement des adipocytes matures intacts. Le sous-hachage et la sous-digestion peuvent entraîner un faible rendement d’adipocytes matures en raison d’une séparation inadéquate du tissu conjonctif. Visuellement, cela peut être observé avec des tissus filandreux restant après le hachage et des amas visibles dans la solution de collagénase. De plus, le hachage excessif et la digestion excessive entraînent également un faible rendement en raison de l’éclatement des adipocytes matures. Visuellement, cela se traduit par la perte de la couche blanche opaque et l’accumulation d’une grande couche lipidique claire et libre. Des niveaux inappropriés de hachage ou de digestion entraîneront une mauvaise isolation des adipocytes.
Une bonne préparation et une bonne digestion du tissu adipeux entraîneront la séparation du tissu en quatre couches distinctes, comme le montre la figure 3. Un certain éclatement des adipocytes entraînant la libération de lipides libres est inévitable ; Cependant, un hachage et une digestion appropriés assureront une rupture minimale des adipocytes. La couche lipidique libre restante et le milieu seront éliminés lors de l’empilement des adipocytes (Figure 4). L’empilement correct des adipocytes est essentiel pour l’isolement efficace des adipocytes matures. Tout lipide libre ou milieu restant entraînera une mauvaise isolation et aura un impact négatif sur les tests fonctionnels en aval, tels que le placage, la lipolyse et l’imagerie cellulaire.
Ce protocole génère une préparation propre des adipocytes matures. Des tests d’imagerie cellulaire et de lipolyse peuvent être effectués pour évaluer la fonction cellulaire et démontrer que les adipocytes matures conservent leur fonction après l’isolement et après la culture pendant une période pouvant aller jusqu’à deux semaines. Le test de lipolyse indique que les adipocytes matures conservent la capacité de répondre à la signalisation cellulaire par la libération de glycérol libre lors de la stimulation du récepteur adrénergique β-3 (Figure 6A,B). Cette capacité est conservée même après 2 semaines de culture et est très comparable à l’activité de lipolyse des explants de tissu adipeux cultivés pendant 24 h (Figure 6C,D). Les adipocytes de mauvaise qualité présenteront une lipolyse atténuée. L’imagerie cellulaire d’adipocytes isolés montre des adipocytes matures uniloculaires ronds et intacts contenant une seule grosse gouttelette lipidique. Les isolements d’adipocytes de mauvaise qualité montreront principalement de grosses gouttelettes d’huile extracellulaires indiquant des adipocytes éclatés.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig01.jpg"> 
Figure 1 : Enrobage d’explants de tissu adipeux. (A) Image d’un dôme matriciel de membrane basale partiellement solidifié avant l’enrobage du tissu. (B) Des images représentatives d’un enrobage tissulaire inapproprié et approprié. Un mauvais enrobage est visible car le tissu semble flotter partiellement ou complètement au-dessus du dôme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig02.jpg"> 
Figure 2 : Schéma d’hachage et de digestion corrects du tissu adipeux. (A) Représentation schématique des étapes de hachage et de digestion des tissus 4.2-4.6. (B) Images représentatives de tissus sous-hachés, optimaux et trop hachés. Le tissu sous-haché a de gros morceaux qui conservent leur forme d’origine. Un tissu trop haché entraîne une augmentation visible des lipides libres entourant le tissu, qui semblent clairs et huileux. (C) Images représentatives de tissus sous-digérés, optimaux et surdigérés. Les tissus sous-digérés contiennent des morceaux de tissu entier restant dans la solution. Les tissus surdigérés présentent une grande couche de lipides libres qui se sépare rapidement de la solution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig03.jpg"> 
Figure 3 : Séparation des couches de tissu adipeux digéré. (A) Image schématique et représentative des couches présentes à la suite de l’étape 5.3. (B) Utilisation d’une pointe de pipette coupée pour enlever la couche adipocytaire mature du tube conique de 50 ml. (C) Technique et placement appropriés de l’aiguille et de la seringue pour retirer le milieu de culture sous la couche adipocytaire mature. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig04.jpg"> 
Figure 4 : Empilement séquentiel d’adipocytes matures. Images séquentielles de l’empilement des adipocytes matures. Des couches de lipides libres, d’adipocytes et de milieux sont marquées. Après chaque essorage, les lipides libres et les milieux sont éliminés. Ceci est répété jusqu’à ce qu’aucun milieu ou lipide libre ne se sépare des adipocytes après une rotation. L’image finale est représentative d’adipocytes matures bien tassés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig05.jpg"> 
Figure 5 : Ensemencement et culture d’adipocytes matures. (A) Schéma de l’ensemencement des adipocytes matures. À l’aide d’une pointe de pipette p200 coupée, des adipocytes emballés sont placés sur la membrane d’un insert de culture cellulaire. L’insert est ensuite inversé dans des puits préremplis de milieux de culture. (B) Une image représentative du placage d’adipocytes matures représentant l’extrémité de pipette coupée déposant des adipocytes sur l’insert transwell. (C) Schémas et images représentatives d’adipocytes correctement emballés et mal emballés plaqués de transpuits, vus du dessus des puits. Les adipocytes correctement emballés apparaissent blancs et opaques, tandis que les adipocytes mal emballés entraînent la formation de gouttelettes lipidiques claires. (D) Schéma de la technique utilisée pour changer de milieu de culture. Une pointe de pipette p200 permet d’évacuer soigneusement le support par les ouvertures de la paroi latérale de l’insert transwell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig06.jpg"> 
Figure 6 : Imagerie d’adipocytes matures et dosage de lipolyse. (A,B) Libération de glycérol par les adipocytes matures sous-cutanés (A) et viscéraux (B). Les adipocytes ont été isolés chez des souris mâles C57BL/6 âgées de 16 semaines nourries avec un régime alimentaire normal. 30 μL d’adipocytes ont été mis en boîte comme décrit à l’étape 7.1 et cultivés pendant 1 ou 10 jours. Les adipocytes ont été traités avec 5 μM de CL-316,243 pendant 1 h, 2 h et 4 h, et des surnageants ont été collectés et analysés pour le glycérol libre. (C, D) Libération de glycérol par les explants de tissu adipeux sous-cutané (C) et viscéral (D). Le tissu adipeux a été isolé chez des souris femelles C57BL/6 âgées de 18 semaines nourries avec un régime alimentaire normal. 0,1 g d’explants de tissu adipeux ont été plaqués comme décrit aux étapes 3.1 à 3.4 et cultivés pendant 24 h. Les adipocytes ont été traités avec 5 μM de CL-316,243 pendant 1 h, 2 h et 4 h, et des surnageants ont été collectés et analysés pour le glycérol libre. N = 3 répétitions techniques pour A-D. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. (E) Images représentatives d’adipocytes matures sous-cutanés et viscéraux isolés. Les adipocytes ont été isolés chez des souris mâles C57BL/6J âgées de 16 semaines nourries avec un régime alimentaire normal. Les adipocytes ont été colorés par coloration à membrane plasmique (rouge) et par coloration des noyaux de Hoechst (bleu). Barres d’échelle : 50 μm ; Grossissement : 60x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sexe</td>
			<td>Diète</td>
			<td>Dépôt</td>
			<td>Difficulté de hachage</td>
			<td>Collagénase : rapport tissulaire</td>
			<td>Temps de digestion suggéré (min)</td>
			<td>Température d’essorage</td>
			<td>Température de lavage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Femelle</td>
			<td rowspan="2">Chow normal</td>
			<td>Sous-cutané</td>
			<td>Dur</td>
			<td>2:1</td>
			<td>12</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscéral</td>
			<td>Douleur moyenne</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Régime riche en graisses</td>
			<td>Sous-cutané</td>
			<td>Facile</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscéral</td>
			<td>Facile</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Mâle</td>
			<td rowspan="2">Chow normal</td>
			<td>Sous-cutané</td>
			<td>Dur</td>
			<td>2:1</td>
			<td>14</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscéral</td>
			<td>Douleur moyenne</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Régime riche en graisses</td>
			<td>Sous-cutané</td>
			<td>Facile</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscéral</td>
			<td>Facile</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Modifications spécifiques au sexe, au dépôt et au régime alimentaire. La difficulté de hachage de chaque tissu, décrite comme « Facile », « Moyenne » ou « Difficile » par rapport aux autres dépôts. Notez que le temps réel de hachage variera en fonction du chercheur et du tissu. Colgénase : Rapport tissulaire indiqué comme le volume (mL) de la solution de collagénase + DNase préparée à l’étape 4.1 par rapport au poids du tissu (g). Le temps de digestion est une estimation approximative, mais le temps réel de digestion variera en fonction du hachage et des tissus. Les chercheurs doivent évaluer la digestion comme décrit dans le protocole. La température d’essorage et la température de lavage diffèrent entre les souris mâles et femelles. RT indique la température ambiante.

Isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses

Adipose tissue is primarily composed of mature, lipid-laden adipocytes by volume. These postmitotic cells play a critical role in energy storage and ...

Notre recherche se concentre sur l’étude de la fonction des adipocytes matures provenant de différents dépôts de graisse et conditions alimentaires. Nous nous intéressons plus particulièrement à comprendre comment les adipocytes matures communiquent avec les cellules environnantes et comment cette diaphonie peut influencer la progression de la maladie et être altérée dans l’obésité. Les adipocytes matures sont des cellules grandes et délicates, ce qui rend inefficaces les méthodes d’isolement cellulaire couramment utilisées telles que le FACS.De plus, des niveaux élevés de lipides libres souvent trouvés dans le tissu adipeux peuvent être toxiques pour les adipocytes matures, compliquant leur maintien. Contrairement aux méthodes couramment utilisées qui reposent sur la différenciation in vitro des préadipocytes, ce protocole nous permet d’étudier des adipocytes isolés ex vivo, qui sont fonctionnellement et transcriptionnellement similaires aux adipocytes in vivo. Ceci est particulièrement important car les adipocytes varient considérablement entre les dépôts de graisse et dans différentes conditions alimentaires.Ce protocole isole efficacement, reflétant les adipocytes matures et est facilement évolutif. Des ajustements sont inclus pour optimiser l’isolement des adipocytes chez des souris de sexes différents et avec des conditions alimentaires différentes. Une fois isolés, les adipocytes peuvent être cultivés, imagés ou utilisés au besoin.Pour commencer, préparez une solution de collagénase avec de la DNase en ajoutant 0,00017 gramme de DNase par millilitre de solution de collagénase, et agitez le mélange pour assurer un mélange complet. À l’aide d’une lame de rasoir, émincez le tissu adipeux isolé des souris jusqu’à ce qu’il apparaisse homogène. Transférez ensuite le tissu haché dans un tube conique stérile de 50 millilitres.Ajoutez la solution préparée de collagénase et de DNase au tissu adipeux haché et tourbillonnez à vitesse maximale pendant sept à 10 secondes pour bien mélanger les composants. Placez ensuite les tubes coniques de 50 millilitres horizontalement dans un agitateur réglé à 220 tr/min à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, retirez les tubes, faites tourner pendant cinq secondes et vérifiez les échantillons.À l’aide d’une pipette sérologique, passez le tissu digéré à travers un tamis dans un nouveau tube conique stérile de 50 millilitres. Ajoutez du FBS égal au volume de tissu et de solution de collagénase à travers le tamis dans le même tube conique pour neutraliser la collagénase. Faites tourner les tubes à 300 G pendant trois minutes à la température indiquée dans le tableau illustré ici.Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, jetez soigneusement la couche supérieure de lipides libres. Ensuite, utilisez une pipette P1000 avec la pointe coupée pour transférer les adipocytes matures dans un tube préparé de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de croissance. Retournez doucement les tubes de 15 millilitres contenant des adipocytes matures trois à cinq fois jusqu’à ce que la couche blanche se disperse dans tout le support.Après avoir laissé reposer les tubes pendant 10 minutes, faites-les tourner à la température préalablement déterminée pour séparer davantage les couches. Après cela, utilisez une pipette pour jeter la couche supérieure de lipides libres. Fixez maintenant une aiguille de calibre 21 à une seringue de cinq millilitres et faites glisser soigneusement l’aiguille le long du bord du tube jusqu’à ce que le bas de l’aiguille se trouve sous la couche du site des adipocytes matures.Ensuite, tirez lentement la seringue vers le haut pour retirer le milieu de culture et tous les débris cellulaires. Ajoutez délicatement 10 millilitres de milieu de culture dans le tube. À l’aide des pointes de pipette de chargement de gel Faites glisser la pointe le long du bord du tube pour retirer le support restant sous la couche adipocytaire mature.Ensuite, centrifugez les cellules à 100 G pendant une minute. À l’aide d’une pipette, prélevez les lipides libres. À l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel, prélever le milieu de culture sous les adipocytes.Retirez les inserts de culture cellulaire d’une plaque de 24 puits traitée pour la culture tissulaire et placez-les, côté membrane vers le haut, sur la surface du capot. Remplissez les puits alternés de la plaque avec des milieux de culture chauds. À l’aide d’une pointe de pipette P200 coupée, transférez 30 microlitres d’adipocytes matures compactés sur le dessus d’un insert Transwell.Ensuite, prenez soigneusement l’insert Transwell, retournez-le et placez-le dans un puits prérempli dans la plaque à 24 puits. Pour retirer le fluide des puits, maintenez l’insert Transwell stable et aspirez avec une pipette P200 à travers les petites ouvertures sur les côtés. Après avoir retiré le média, tout en maintenant le Transwell en place, ajoutez lentement un millilitre de média frais le long de la paroi latérale du puits.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

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