Isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses

Notre recherche se concentre sur l’étude de la fonction des adipocytes matures provenant de différents dépôts de graisse et conditions alimentaires. Nous nous intéressons plus particulièrement à comprendre comment les adipocytes matures communiquent avec les cellules environnantes et comment cette diaphonie peut influencer la progression de la maladie et être altérée dans l’obésité. Les adipocytes matures sont des cellules grandes et délicates, ce qui rend inefficaces les méthodes d’isolement cellulaire couramment utilisées telles que le FACS.

De plus, des niveaux élevés de lipides libres souvent trouvés dans le tissu adipeux peuvent être toxiques pour les adipocytes matures, compliquant leur maintien. Contrairement aux méthodes couramment utilisées qui reposent sur la différenciation in vitro des préadipocytes, ce protocole nous permet d’étudier des adipocytes isolés ex vivo, qui sont fonctionnellement et transcriptionnellement similaires aux adipocytes in vivo. Ceci est particulièrement important car les adipocytes varient considérablement entre les dépôts de graisse et dans différentes conditions alimentaires.

Ce protocole isole efficacement, reflétant les adipocytes matures et est facilement évolutif. Des ajustements sont inclus pour optimiser l’isolement des adipocytes chez des souris de sexes différents et avec des conditions alimentaires différentes. Une fois isolés, les adipocytes peuvent être cultivés, imagés ou utilisés au besoin.

Pour commencer, préparez une solution de collagénase avec de la DNase en ajoutant 0,00017 gramme de DNase par millilitre de solution de collagénase, et agitez le mélange pour assurer un mélange complet. À l’aide d’une lame de rasoir, émincez le tissu adipeux isolé des souris jusqu’à ce qu’il apparaisse homogène. Transférez ensuite le tissu haché dans un tube conique stérile de 50 millilitres.

Ajoutez la solution préparée de collagénase et de DNase au tissu adipeux haché et tourbillonnez à vitesse maximale pendant sept à 10 secondes pour bien mélanger les composants. Placez ensuite les tubes coniques de 50 millilitres horizontalement dans un agitateur réglé à 220 tr/min à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, retirez les tubes, faites tourner pendant cinq secondes et vérifiez les échantillons.

À l’aide d’une pipette sérologique, passez le tissu digéré à travers un tamis dans un nouveau tube conique stérile de 50 millilitres. Ajoutez du FBS égal au volume de tissu et de solution de collagénase à travers le tamis dans le même tube conique pour neutraliser la collagénase. Faites tourner les tubes à 300 G pendant trois minutes à la température indiquée dans le tableau illustré ici.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres, jetez soigneusement la couche supérieure de lipides libres. Ensuite, utilisez une pipette P1000 avec la pointe coupée pour transférer les adipocytes matures dans un tube préparé de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de croissance. Retournez doucement les tubes de 15 millilitres contenant des adipocytes matures trois à cinq fois jusqu’à ce que la couche blanche se disperse dans tout le support.

Après avoir laissé reposer les tubes pendant 10 minutes, faites-les tourner à la température préalablement déterminée pour séparer davantage les couches. Après cela, utilisez une pipette pour jeter la couche supérieure de lipides libres. Fixez maintenant une aiguille de calibre 21 à une seringue de cinq millilitres et faites glisser soigneusement l’aiguille le long du bord du tube jusqu’à ce que le bas de l’aiguille se trouve sous la couche du site des adipocytes matures.

Ensuite, tirez lentement la seringue vers le haut pour retirer le milieu de culture et tous les débris cellulaires. Ajoutez délicatement 10 millilitres de milieu de culture dans le tube. À l’aide des pointes de pipette de chargement de gel Faites glisser la pointe le long du bord du tube pour retirer le support restant sous la couche adipocytaire mature.

Ensuite, centrifugez les cellules à 100 G pendant une minute. À l’aide d’une pipette, prélevez les lipides libres. À l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel, prélever le milieu de culture sous les adipocytes.

Retirez les inserts de culture cellulaire d’une plaque de 24 puits traitée pour la culture tissulaire et placez-les, côté membrane vers le haut, sur la surface du capot. Remplissez les puits alternés de la plaque avec des milieux de culture chauds. À l’aide d’une pointe de pipette P200 coupée, transférez 30 microlitres d’adipocytes matures compactés sur le dessus d’un insert Transwell.

Ensuite, prenez soigneusement l’insert Transwell, retournez-le et placez-le dans un puits prérempli dans la plaque à 24 puits. Pour retirer le fluide des puits, maintenez l’insert Transwell stable et aspirez avec une pipette P200 à travers les petites ouvertures sur les côtés. Après avoir retiré le média, tout en maintenant le Transwell en place, ajoutez lentement un millilitre de média frais le long de la paroi latérale du puits.