Mesure par cytométrie en flux à haut débit du mécanotype cellulaire basée sur la rupture et l’administration de sondes de tension d’ADN dans les cellules

Notre laboratoire étudie généralement les mécanismes moléculaires utilisés par les cellules pour transmettre des stimuli mécaniques. Récemment, nous avons développé des méthodes à haut débit pour mesurer les forces que les cellules exercent sur leur environnement afin d’amener la mécanobiologie dans l’ère omique. Des études impliquent des forces mécaniques dans la façon dont les lymphocytes T sont activés par le bon antigène et comment les cellules souches se différencient en types de cellules spécialisés.

Récemment, le ciblage des processus sous-jacents à la mécanique cellulaire dérégulée a conduit au développement de mécanothérapies comme moyen de traiter la maladie. Les capteurs duplex et en épingle à cheveux mesurent les forces extracellulaires, tandis que les capteurs génétiquement codés permettent des mesures intracellulaires. Presque tous nécessitent des microscopes haut de gamme.

La microscopie à force de traction peut mesurer la force que les cellules exercent sur leur environnement, mais elle implique également une imagerie à haute résolution. Dans ce travail, nous abordons trois défis sur le terrain : premièrement, utiliser la cytométrie en flux pour la mesure de la force au lieu de l’imagerie, deuxièmement, utiliser la technologie HOH tag pour attacher des ligands et des anticorps aux sondes d’ADN, et troisièmement, utiliser des plaques de culture cellulaire standard sans traitements de surface spéciaux. Comment les changements des forces générées par les cellules peuvent-ils être utilisés comme marqueur pronostique de l’état pathologique, et ces forces contribuent-elles à, ou sont-elles un effet secondaire de cet état pathologique ?

Pour commencer, assemblez des duplex dans un rapport de 1,1 à une molaire entre un brin d’ancrage avec trempe et un ligand avec fluorophore. Préparez les duplex à une concentration finale de 40 brins de ligands micromolaires dans la solution. Pour recuire les duplex assemblés, incubez-les à 98 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, laissez refroidir le mélange à température ambiante pendant une heure à l’abri de la lumière. Faites réagir les duplex recuits avec HUH en utilisant la concentration du brin le moins abondant de l’étape de recuit, qui dans ce cas, est le brin ligand. Mélangez les duplex avec HUH dans un rapport d’une à deux molaires à une concentration finale de 10 micromolaires duplex et 20 micromolaires HUH.

Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un thermocycleur ou un bloc chauffant protégé de la lumière. Après l’incubation, retirez la réaction de la chaleur et utilisez une mini-centrifugeuse de paillasse pour faire tourner les attaches de jauge de tension maintenant assemblées, ou TGT. Lorsque les TGT adhèrent correctement, lavez les puits avec les cellules souhaitées trois fois avec du PBS.

Poursuivez avec deux lavages à l’aide d’un milieu sans sérum et laissez le milieu dans les puits après le lavage final. Ajoutez 200 microlitres de PBS dans les puits périphériques pour atténuer les effets de bord. Transférez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour préchauffer l’assiette.

Ensuite, récupérez les cellules d’intérêt à environ 80 % de confluence. Aspirez le milieu, puis lavez les cellules avec du PBS et incubez les cellules avec de la trypsine à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules se dissocient, ce qui prend environ cinq à dix minutes. Une fois les cellules dissociées, ajoutez le volume original du milieu cellulaire complet utilisé pour maintenir les cellules.

Remettez les cellules en suspension à l’aide d’une pipette sérologique et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 300 G pendant quatre minutes. Aspirez le média et remettez le plomb en suspension dans PBS.

Après avoir répété la centrifugation, remettre les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu sans sérum et centrifuger à nouveau. Aspirez et mettez en suspension les cellules dans environ deux millilitres de milieu sans sérum. Déterminez la densité des cellules remises en suspension pour ajuster la concentration comme vous le souhaitez.

Si vous testez les effets du médicament, ajoutez la concentration appropriée du médicament dans les cellules et renvoyez les cellules dans l’incubateur pendant le temps de pré-incubation avant de continuer. Maintenant, récupérez la plaque d’origine de l’incubateur et retirez les fluides résiduels laissés par le lavage dans les puits expérimentaux. Lavez une fois les puits avec le milieu souhaité et pipetez 100 microlitres des cellules remises en suspension dans les puits souhaités.

Transférez les cellules plaquées dans l’incubateur pendant 90 minutes. Après l’incubation, retirer environ 125 à 170 microlitres de volume de chaque puits. Si nécessaire, lavez doucement les cellules avec 200 microlitres de PBS réchauffé.

Ensuite, incubez les cellules dans chaque puits avec 50 microlitres de trypsine jusqu’à ce que les cellules commencent à se dissocier, ce qui prend environ cinq à 10 minutes. Ensuite, ajoutez 160 microlitres de tampon d’écoulement fraîchement préparé dans chaque puits. Pipetez doucement de haut en bas pour dissocier les cellules.

Transférez 196 microlitres de cette suspension cellulaire dans des tubes PCR, ajoutez quatre microlitres d’iodure de propidium et mélangez doucement. Enfin, placez les tubes dans un seau à glace avec un couvercle bloquant toute lumière et mesurez l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un cytomètre en flux. La cytométrie en flux a confirmé l’isolement réussi de cellules uniques vivantes, garantissant une analyse précise des mécanotypes.

Un contrôle négatif, fixé au 99e centile de la fluorescence Cy5-A, a fourni une base de référence pour la comparaison des conditions expérimentales. Les cellules CHO-K1 traitées avec Y27632 ont montré une diminution significative du pourcentage de cellules dépassant la porte de contrôle négative sur les TGT de cisaillement, tandis que les TGT décompressés n’ont montré qu’une diminution modeste et statistiquement non significative. Le dézippage des TGT a systématiquement entraîné un pourcentage plus élevé de cellules dépassant le contrôle négatif par rapport aux TGT de cisaillement, confirmant leur force requise plus faible.