Isolement et identification de souches bactériennes dans la peau d’amphibiens terrestres

Cette recherche visait à développer un protocole efficace pour collecter le microbiote cutané des amphibiens terrestres sauvages et à assurer l’intégrité microbienne pendant le stockage et la manipulation.

Les principaux défis comprennent la prévention de la contamination des échantillons, le maintien de la viabilité microbienne pendant le stockage et l’élevage d’une croissance lente pour évaluer pleinement la diversité du microbiote cutané des amphibiens.

Il a été établi que la solution saline enrichie en glycérol préserve l’intégrité du microbiote cutané des amphibiens pendant le stockage et la manipulation, la culture bactérienne cohérente et l’amélioration des stratégies de conservation microbienne pour la recherche écologique et biotechnologique.

Ce protocole vise à remédier à l’absence de méthodes d’échantillonnage normalisées, préserve et manipule les bactéries cutanées des amphibiens cultivables et garantit l’intégrité de la communauté.

[Narrateur] Pour commencer, stérilisez le milieu en autoclave à 121 à 134 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes. Après l’autoclavage, laissez le milieu gélosé refroidir à environ 45 à 50 degrés Celsius. Sous une hotte à flux laminaire préalablement stérilisée, versez le milieu refroidi dans des boîtes de Pétri stériles. Une fois que la gélose s’est solidifiée, étiquetez les boîtes de Pétri avec le type de milieu et la date de préparation. Mélangez l’échantillon obtenu sur le terrain avec la solution en poussant l’écouvillon contre les parois du tube tout en pressant le tube et en tournant l’écouvillon à fond, 10 fois dans le sens des aiguilles d’une montre et 10 fois dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Bien mélanger l’échantillon microbiologique avant le traitement. Préparer une dilution en série de l’échantillon cutané avec une solution saline allant de 10 à la puissance -1 à 10 à la puissance -6. Inoculer 100 microlitres de l’échantillon non dilué et dilution en série sur les plaques de gélose préparées. À l’aide d’une boucle stérile en forme de L, passez l’échantillon sur la surface du milieu gélosé en assurant une distribution uniforme sans appliquer de pression excessive. Retournez les plaques inoculées et placez-les dans un incubateur réglé à 20 à 25 degrés Celsius pendant trois à cinq jours pour favoriser la croissance des bactéries mésophiles et psychotropes sur la peau des amphibiens. Après l’incubation, sélectionnez des colonies bactériennes aux morphologies distinctes pour une analyse plus approfondie. Assurez-vous que les colonies sont bien isolées et présentent des apparences différentes, telles que des variations de couleur, de taille, de forme, de bord, de surface ou de texture. Pour sous-cultiver les colonies sélectionnées, transférez une colonie bien isolée de la plaque de gélose d’origine à une plaque de gélose fraîche à l’aide d’une boucle d’inoculation dans des conditions aseptiques. Striez la colonie pour l’isoler. Et puis incubez-le de manière appropriée. La procédure d’échantillonnage coordonnée d’un individu speleomantes italicus à l’aide d’outils stériles sur le terrain est illustrée ici. L’échantillonnage a été effectué par deux opérateurs à l’aide de gants et d’écouvillons stériles afin de minimiser le stress sur l’amphibien et d’assurer la précision lors de la manipulation. L’écouvillon a été immédiatement transféré dans une solution saline contenant 20 % de glycérol afin de préserver l’intégrité microbienne pendant le transport vers le laboratoire. Une comparaison de la densité de la communauté microbienne conservée dans une solution saline avec et sans ajout de glycérol est présentée ici. La charge bactérienne dans le stockage salin sans glycérol était significativement plus faible que dans le contrôle et le sérum physiologique avec glycérol. La communauté microbienne stockée dans une solution saline avec du glycérol a montré une charge bactérienne similaire à celle du témoin, indiquant la préservation de l’intégrité microbienne. La meilleure préservation de la communauté microbienne a été observée dans une solution saline avec du glycérol stocké à quatre degrés Celsius, montrant la charge bactérienne la plus stable au fil du temps. Le stockage dans une solution saline seule à température ambiante a entraîné la croissance bactérienne la plus élevée, indiquant une contamination microbienne ou une promotion sélective de certains groupes bactériens. Le gel à moins 20 degrés Celsius a réduit la charge bactérienne, ce qui suggère que les basses températures ont eu un impact négatif sur la survie microbienne.