Utilisation de l’assemblage in vivo pour la construction de plasmides à haut rendement

Ma recherche doctorale est axée sur l’étude des protéines sécrétées par les bactéries. Je veux spécifiquement comprendre si certaines de ces protéines sécrétées sont importantes pour provoquer des infections humaines. L’un des principaux défis du travail avec des bactéries cliniques récemment isolées est leur résistance aux antibiotiques, qui entrave les techniques de génétique moléculaire qui reposent sur la sélection d’antibiotiques, telles que les délétions de gènes et la complémentation génétique.

Ce protocole de clonage est plus rapide et plus rentable puisque l’IVA élimine le besoin d’enzymes spécialisées et de réactions enzymatiques séquentielles pour l’assemblage des plasmides avant la transformation d’E. coli. Pour commencer, lancez un logiciel d’analyse d’ADN spécialisé sur un système informatique. Assemblez artificiellement le plasmide souhaité.

Ensuite, concevez des amorces qui se lient à chaque fragment d’ADN. Combinez l’ADN isolé à l’aide de kits commerciaux avec les amorces contenant de l’ADN homologue dans un tube PCR. Ensuite, amplifiez l’ADN avec une PCR.

Une fois la réaction PCR terminée, pipetez une aliquote de deux microlitres. Combinez-le avec du colorant de chargement. Effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose sur un gel d’agarose à 1 % pour séparer les fragments d’ADN.

Utilisez ensuite un illuminateur ultraviolet ou LED pour visualiser les fragments. Ensuite, ajoutez un microlitre de DpnI directement dans le tube de réaction PCR pour éliminer l’ADN matrice méthylé. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes ou toute la nuit.

Avec un kit de purification d’acide nucléique, éliminez les enzymes résiduelles, les sels, les dimères d’amorce et les produits d’ADN de faible poids moléculaire. Quantifier la concentration d’ADN des fragments purifiés à l’aide de la spectrophotométrie. Obtenez de l’ADN plasmidique amplifié pur.

Calculez la quantité de plasmide et d’ADN d’insertion requise pour chaque réaction d’assemblage in vivo. Maintenant, combinez les volumes calculés de plasmide et insérez l’ADN dans un microtube à centrifuger pré-refroidi de 1,5 millilitre. Placez le tube sur de la glace.

Ensuite, pipetez 25 à 100 microlitres d’Escherichia coli chimiquement compétent décongelé dans un tube. Transférez le mélange d’ADN dans l’aliquote. Pour effectuer une transformation par choc thermique, incubez d’abord le mélange d’E. coli et d’ADN sur de la glace pendant 30 minutes.

Transférez le tube dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant une minute. Ensuite, transférez-le sur de la glace pendant deux minutes. Transférez aseptiquement le support LB dans le tube pour augmenter le volume à un millilitre.

Transférez le mélange d’un millilitre dans un tube de culture en verre. Ensuite, placez-le dans un incubateur à agitation pour la récupération et la production du marqueur de sélection d’antibiotiques codé par le plasmide. Après récupération, déposer environ 100 à 1 000 microlitres de la réaction de transformation sur des milieux de sélection solides.

Utilisez un épandeur de cellules stériles pour disperser l’aliquote sur la plaque de culture à la nageoire. Centrifugez les cellules transformées restantes à 13 000 G pendant une minute. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres de milieu stérile.

Déposez les cellules remises en suspension sur un milieu de sélection solide comme indiqué précédemment. Ensuite, retournez les plaques de culture. Placez-les dans un incubateur pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Retirer de l’incubateur les plaques de culture contenant des cultures transformées d’E. coli. Comptez directement les colonies à dénombrer. Transférez des milieux de croissance stériles complétés par des antibiotiques appropriés dans des tubes de culture stériles.

À l’aide d’une boucle de transfert stérile, prélevez une colonie et inocunez les cellules dans le milieu de culture. Incuber les tubes de culture dans un incubateur à agitation. Le lendemain, isolez l’ADN plasmidique des cultures bactériennes à l’aide d’un kit d’isolement de plasmide disponible dans le commerce.

Pour déterminer si les plasmides sont correctement assemblés, utilisez la spectrophotométrie pour quantifier la concentration d’ADN. Pipeter une aliquote de 50 à 150 nanogrammes d’ADN plasmidique pour une réaction de digestion de restriction diagnostique. Ajoutez des enzymes de restriction sélectionnées en fonction de leurs sites de clivage attendus sur l’ADN plasmidique.

Une fois la réaction de restriction terminée, ajoutez le colorant de chargement dans le tube. Chargez tout le mélange sur un gel d’agarose à 1 % et effectuez un passage électrophorétique. Après l’exécution, visualisez les fragments d’ADN avec un illuminateur trans UV ou LED pour les comparer à ce dernier.

La digestion enzymatique de deux clones de plasmides isolés a permis d’obtenir un seul produit d’ADN de 2,3 paires de kilobases pour le clone de plasmide 1, ce qui indique qu’il s’agit du PSU 19 seul. Le clivage simple du clone plasmidique 2 a donné un seul produit d’ADN de trois paires de kilobases, et deux produits d’ADN de 2,3 paires de kilobases et 770 paires de kilobases après double clivage.