Name: Utilisation de l’assemblage in vivo pour la construction de plasmides à haut rendement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Découvrez l'assemblage in vivo pour le clonage d'ADN à haut rendement dans E. coli. Cette méthode efficace et économique atteint 99% d'efficacité de clonage sans enzymes spécialisés.

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<ol><li>Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertero%2C+A+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22">Basic Science Methods for Clinical Researchers</a>. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).</li>
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<li>Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+construction+by+homologous+recombination+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmid construction by homologous recombination in yeast.</a> Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).</li>
<li>Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+multiple+DNA+fragments+through+direct+transformation+of+PCR+products+into+E.+coli+and+Lactobacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus.</a> Plasmid. 76, 40-46 (2014).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+rearrangement+of+plasmid+DNA+during+transformation+of+Escherichia+coli+with+linear+plasmid+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intramolecular+recyclization+and+deletion+formation+following+transformation+of+Escherichia+coli+with+linearized+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).</li>
<li>Sung, W. L., Zahab, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+directed+by+single-stranded+crossover+linkers%3A+specific+deletion+of+the+amino-terminal+region+of+the+beta-galactosidase+gene+in+pUC+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22DNA%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids.</a> DNA. 6 (4), 373-379 (1987).</li>
<li>Mandecki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+double-strand+break+repair+in+plasmids+of+Escherichia+coli%3A+a+method+for+site-specific+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).</li>
<li>Jones, D. H., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+recombination+and+site-specific+mutagenesis+by+placing+homologous+ends+on+DNA+using+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).</li>
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<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+plasmid+cloning+with+a+universal+MCS+design+and+bacterial+in+vivo+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly.</a> BMC Biotechnol. 21 (1), 24(2021).</li>
<li>Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+plasmid+series+for+rapid+sub-cloning+and+use+in+various+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae.</a> J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).</li>
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<li>Bzymek, M., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+repetitive+DNA+sequences%3A+The+role+of+replication+in+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
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<li>Fürste, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+plasmid+RP4+primase+region+in+a+multi-host-range+tacP+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector.</a> Gene. 48 (1), 119-131 (1986).</li>
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<li>Godiska, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+plasmid+vector+for+cloning+of+repetitive+or+unstable+sequences+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).</li>
<li>Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+DNA+assembly+using+common+laboratory+bacteria%3A+A+re-emerging+tool+to+simplify+molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning.</a> J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus Échelle d’ADN</td><td>FroggaBio</td><td>DM015-R500</td><td>Marqueur de poids moléculaire d’ADN</td></tr><tr><td>AccuReady M Monocanal 0.5-10 &micro ; L</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPP020</td><td>Pipettes pour le transfert de liquide</td></tr><tr><td>AccuReady M Kit de pipette monocanal</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPK100</td><td>Pipettes pour le transfert de liquide</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003.1</td><td>Agent solidifiant pour milieu de croissance</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td>Fabriquer des gels d’agarose pour l’électrophorèse de l’ADN</td></tr><tr><td>Biometra TOne&nbsp ;</td><td>Analytikjena</td><td>846-2-070-301</td><td>Bouchons thermocycleurs</td></tr><tr><td>pour tubes de culture en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-957-91</td><td>Bouchons réutilisables pour tubes de culture en verre</td></tr><tr><td>amorces d’ADN</td><td>Technologies d’ADN intégrées</td><td>N/A</td><td>Lier et amplifier l’ADN modèle dans la réaction PCR</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp ;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Cleave ADN matrice méthylé après amplification par PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>Enzyme de restriction, livrée avec un tampon approprié</td></tr><tr><td>Microtubes Eppendorf 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td>Microtube, 1,5 mL, base conique, PP, capuchon plat attaché, graduations moulées et espace d’écriture givré</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL0748203</td><td>Agent de visualisation/intercalation de l’ADN, toxique</td></tr><tr><td>EZ-10 Spin Column Plasmidique Miniprep Kit</td><td>Biobasic</td><td>BS614</td><td>Isolat de l’ADN plasmidique à partir de cultures bactériennes nocturnes</td></tr><tr><td>Système GelDoc Go-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>12009077</td><td>Imagerie Gels d’ADN</td></tr><tr><td>Tubes de culture en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-925E</td><td>Tubes de culture en verre</td></tr><tr><td>myGel&nbsp ; Mini système d’électrophorèse</td> Système <td>de Z742288</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>utilisé pour l’électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>Déterminer la concentration d’ADN</td></tr><tr><td>PCR Nettoyage pour le séquençage de l’ADN</td><td>Biobasic</td><td>BT5100</td><td>Purifier les produits PCR&nbsp ;</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.011</td><td>Boîte de Pétri 92 x 16 mm, PS, transparente, avec cames de ventilation</td></tr><tr><td>Pointe de pipette, 1000 & micro ; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.305</td><td>Pointes de pipette pour 100-1000 & micro ; L</td></tr><tr><td>Pointe de pipette, 2,5 & micro ; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3010.265</td><td>Pointes de pipette jusqu’à 2,5 & micro ; L</td></tr><tr><td>Pointe de pipette, 20 & micro ; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3020.200</td><td>Pointes de pipette jusqu’à 20 & micro ; L</td></tr><tr><td>Pointe de pipette, 200 & micro ; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.020</td><td>Pointes de pipette pour 1-200 & micro ; L</td></tr><tr><td>Sel (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>Composant du milieu de croissance bactérienne (10 g/L)</td></tr><tr><td>Tubes PCR simples de 0,2 mL avec bouchon plat</td><td>Tubes PCR</td><td>FroggaBio</td><td>TF-1000</td></tr><tr><td>Tryptone (bactériologique)</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402.5</td><td>Composant du milieu de croissance bactérienne (10 g/L)</td></tr><tr><td>VeriFi ADN polymérase</td><td>PCR Biosystems</td><td>PB10.42-01</td><td>Polymérase haute fidélité, le tampon PCR contenant Mg2+ et dNTPs est fourni avec purchase</td></tr><tr><td>Xba I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>Enzyme de restriction, livré avec tampon approprié</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401.205</td><td>Composant du milieu de croissance bactérienne (5 g/L)</td></tr></tbody></table>

utilisation de l’assemblage in vivo pour la construction de plasmides à haut rendement

Use of In Vivo Assembly for High-efficiency Plasmid Construction

Dans ce manuscrit, à titre d’exemple d’utilisation de l’IVA, nous avons suivi le flux de travail IVA fourni pour recloner le cadre de lecture ouvert mCherry dans le site de clonage multiple du plasmide pSU19 afin de générer un plasmide identique à pSU19mCherry (Figure 3)17. Les amorces adaptées à l’IVA ont été conçues sur la base des étapes de protocole 1.1 et 1.2. Ensuite, un kit d’isolement plasmidique a été utilisé pour isoler pSU19 et pSU18mCherry, qui ont servi d...

Utilisation de l’assemblage in vivo pour la construction de plasmides à haut rendement

In vivo assembly (IVA) is a molecular cloning method that uses intrinsic enzymes present in bacteria that promote intermolecular recombination of DNA ...

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Une méthode rapide et efficace d'intégrer l'ADN étranger dans des souches d'intérêt accepteurs pré-faites, dites souches piste d'atterrissage, est décrite. Procédé permettant d'intégration spécifique de site d'une cassette d'ADN dans le locus piste d'ingénierie d'une souche donnée, par conjugaison et l'expression de l'intégrase ΦC31.

Site spécifique génie chromosome bactérien: ΦC31 intégrase médiation Cassette Exchange (IMCE)

Source : Tomás, J. M., et al. Génération de mutants nuls pour élucider le rôle des glycosyltransférases bactériennes dans la motilité bactérienne. J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo démontre l’amplification dépendante de l’initiateur d’un plasmide suicide chez E. coli. Le plasmide, qui porte un gène de résistance aux antibiotiques, ne se réplique qu’en présence d’une protéine initiatrice codée par l’hôte. Après électroporation et incubation dans un milieu de récupération, le mélange est plaqué sur...

Amplification d’un plasmide suicide chez un hôte bactérien

Les méthodologies de ciblage génique peuvent être utilisées pour générer des souris transgéniques avec des allèles knockout, knock-in et marqués.  Ici, nous décrivons une méthode améliorée de recombinaison chez E. coli, que nous appelons « sous-clonage plus insertion », qui peut être utilisée pour générer rapidement des vecteurs de ciblage génique personnalisés.

Sous-clonage plus insertion (SPI) - Un Recombineering nouveau procédé pour la construction rapide de ciblage de gène Vecteurs

La synthèse de plasmides personnalisés demande beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Ce protocole décrit l’utilisation du clonage d’assemblage Gibson pour réduire le travail et la durée de la procédure de clonage d’ADN personnalisé. Le protocole décrit produit également des constructions protéiques marquées fiables pour l’expression des mammifères à un coût similaire au clonage traditionnel de l’ADN par copier-coller.

Génération de vecteurs plasmidiques exprimant des protéines de marquage Flag En vertu du règlement de l&#39;allongement Human Factor-1α promoteur Utilisation Assemblée Gibson

Domaines à doigt de zinc sont intrinsèquement perméable cellule et capable de médier la délivrance de protéines dans une large gamme de types de cellules de mammifères. Ici, un protocole étape par étape détaillé pour la mise en œuvre de la technologie à doigt de zinc pour la livraison de protéine intracellulaire est présenté.

Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domaines doigt de zinc

Ici, nous présentons l'assemblage de la chimère par récupération du plasmide et l'insertion du site enzymatique de restriction (CAPRRESI), un protocole basé sur l'insertion des sites d'enzymes de restriction dans des séquences d'ADN synonymes et une récupération fonctionnelle du plasmide. Ce protocole est une méthode rapide et peu coûteuse pour fusionner des gènes codant pour des protéines.

CAPRRESI: Assemblage de la chimère par insertion de plasmides et restriction Enzyme Site Insertion

Nous présentons ici un protocole pour produire de grandes quantités d’ARN recombiné dans Escherichia coli en exprimant conjointement un ARN chimérique qui contient de l’ARN d’intérêt à un échafaudage viroïde et une usine ligase d’ARNt. Le produit principal est une molécule circulaire qui facilite la purification jusqu'à homogénéité.

Production à grande échelle d’ARN Recombinant sur un échafaudage circulaire utilisant un système dérivé de Viroid chez Escherichia coli

L’objectif de ce protocole est de fournir un guide détaillé, étape par étape, pour l’assemblage de constructions multigéniques à l’aide du système modulaire de clonage basé sur le clonage Golden Gate. Il formule également des recommandations sur les étapes critiques pour assurer un assemblage optimal en fonction de nos expériences.

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Cet article présente un protocole étape par étape démontrant comment le clonage modulaire (MoClo) peut être adapté au clonage d’opérons polycistroniques.

Assemblage modulaire standardisé d’opérons polycistroniques avec clonage modulaire (MoClo) à l’aide de la boîte à outils In-Cloning

L’étude actuelle décrit un flux de travail pour le séquençage nanopore des plasmides lorsque la séquence chromosomique est déjà connue ou sans intérêt. Une étape initiale d’enrichissement de l’ADN plasmidique assure une profondeur optimale de séquence plasmidique et maximise le nombre d’échantillons pouvant être séquencés par cellule de flux.

Séquençage et assemblage de plasmides à longue lecture utilisant des flux de travail basés sur le séquençage nanopore

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