Analyse des sous-populations plaquettaires par cytométrie en flux multicolore

Notre recherche utilise la cytométrie en flux multicolore pour identifier et caractériser les sous-populations de plaquettes, dans le but de comprendre les rôles, les modèles d’activation et la pertinence clinique dans la thrombose, l’inflammation et le contexte spécifique à la maladie. Le test cytométrique en flux multicolore établi a permis d’observer le , un agoniste plaquettaire induit un schéma d’activation distinct et, par rapport au peptide lié au collagène, génère un procoagulant et de sous-population. Le test multicolore permet de mesurer simultanément l’activation, l’adhésion, l’agrégation et le potentiel apoptotique des plaquettes d’une seule plaquette au sein d’une population de plaquettes humaines isolées dans un seul tube.

[Instructeur] Pour commencer, préparez tous les réactifs nécessaires à la procédure. Maintenant, mélangez 10 millilitres de tampon 10x Tyrode avec 90 millilitres d’eau distillée. Ajoutez 0,1 gramme de glucose et ajustez le pH du volume complet avec des hepes pour atteindre 7,4. Tout d’abord, réglez le pH de 10 millilitres du tampon à 7,4, puis ajustez le pH des 90 millilitres restants avec un acide chlorhydrique normal à 6,5. Pour le prélèvement d’échantillons de sang, préparez une seringue de 10 millilitres pour chaque donneur avec deux millilitres d’anticoagulant ACD. Laissez la seringue s’équilibrer à température ambiante. Après avoir recueilli le sang du donneur dans une seringue ACD préchauffée, transférez lentement le sang traité ACD dans un tube de réaction de 15 millilitres. Centrifugez le sang traité par ACD à 209G pendant 20 minutes à température ambiante sans utiliser la pause. Pendant ce temps, préparez 25 millilitres de tampon Hepes de Tyrode, pH 6,5 dans un tube de réaction de 50 millilitres. Après la centrifugation, transférez doucement la couche supérieure de plasma riche en plaquettes dans le tube contenant le tampon Hepes de Tyrode. Pour éviter la contamination, laissez environ un millilitre de plasma riche en plaquettes au-dessus de la couche leucocytaire et de la couche érythrocytaire. Ensuite, centrifugez la suspension à 430G pendant 10 minutes à température ambiante pour granuler les plaquettes. Jetez le surnageant et remettez soigneusement la pastille plaquettaire en suspension dans 200 à 300 microlitres de tampon Tyrode, ajusté à pH 7,4. Mesurez le nombre de plaquettes à l’aide d’un compteur de cellules avant de l’ajuster à 200 000 plaquettes par microlitre avec le tampon Hepes de Tyrode à pH 7,4. Pour les récepteurs qui ne nécessitent pas d’activation avant la coloration, notamment CD61, CD42B, CD41, CXCR7 et CXCR4, préparez un échantillon non coloré et un échantillon coloré par anticorps. Pour les récepteurs ou les marqueurs qui nécessitent une activation tels que PAC-1, CD63, CD62P, NXN5 et le NIR zombie. Activez l’échantillon avec 10 microgrammes par millilitre de CRPXL et préparez les échantillons activés et non activés. Pour activer les plaquettes, incubez-les avec 10 microgrammes par millilitre de CRPXL pendant 30 minutes. Ensuite, incubez la plaquette isolée avec des concentrations variables de l’anticorps conjugué au fluorochrome ou mourez pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de tampon de liaison à l’anexine à chaque échantillon pour le diluer. Mesurez 10 000 événements pour chaque échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux. Calculez l’indice de coloration de chaque anticorps afin de déterminer la séparation optimale entre les populations positives et négatives. Tracez l’indice de coloration en fonction des concentrations d’anticorps pour identifier la concentration optimale pour chaque anticorps. Pour la coloration, dissolvez la poudre d’hemen dans de l’hydroxyde de sodium 1,4 M pour créer une solution 3M. Chauffez la solution à 96 degrés Celsius pendant cinq minutes à 450 tours par minute. Diluez-le avec de l’eau distillée pour obtenir une solution de tige de trois millimolaires. Après avoir ajusté le nombre de plaquettes à 1 million de plaquettes par échantillon, activez les plaquettes comme démontré précédemment. Ajoutez 43,3 microlitres de cocktail d’anticorps à chaque échantillon et incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après l’incubation, diluer chaque échantillon avec 300 microlitres d’un X et d’un X dans un tampon de liaison composé de 10 millimolaires d’hydroxyde de sodium Hepes à pH 7,4. Mesurez immédiatement chaque échantillon coloré à l’aide du cytomètre en flux. Pour compenser avec des billes, préparez 150 microlitres de PBS pour chaque fluorophore et ajoutez une goutte de billes et un microlitre de l’anticorps conjugué à la fluorescence. Pour compenser l’annexine V, utilisez les sept billes PECY7B marquées avec du CD 62L anti-humain conjugué au même fluorophore que l’annexine V. Utilisez des billes de compensation réactives amines pour le colorant réactif amine en mélangeant deux gouttes de billes positives et une goutte de billes négatives dans 150 microlitres de PBS avec un microlitre de matrice. Vérifiez que les billes positives réagissent et affichent un signal et que les billes négatives ne le font pas. Préparez une fluorescence moins un contrôle pour chaque marqueur. Les diagrammes de dispersion ont montré un net changement dans la population de plaquettes. L’hémine formant plus de plaquettes avec une faible diffusion vers l’avant que les autres agonistes. Le traitement par thrombine ADP et CRPXL a donné 40 à 60 % des plaquettes CD42 positives, tandis que l’hémine a considérablement réduit cette population. Tous les agonistes plaquettaires n’ont eu aucun effet sur l’expression de surface des CD41 et CD61. Seul hemen a significativement augmenté l’expression de surface de CXCR4 et CXCR7. De plus, l’exposition à la phosphatidylsérine a également été augmentée sous traitement à l’hémine, ce qui a entraîné une augmentation des cellules positives à l’annexine V. Les analyses UMAP et les graphes de phénol ont défini 27 amas plaquettaires distincts, qui variaient selon le type d’agoniste. Hemin a provoqué le changement le plus spectaculaire dans les modèles de grappes. Les sous-populations plaquettaires au repos ont été le plus préservées avec de l’ADP et louées avec de l’hémine.