FISH sensible au polymorphisme mononucléotidique Détection de la transcription de l’ARN ribosomique spécifique du locus chez Drosophila melanogaster
28 mars 2025
Le protocole décrit la méthode d’hybridation par fluorescence in situ sensible aux polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP-FISH) pour distinguer les transcrits d’ARN ribosomique dérivés du locus de l’ADN ribosomique du chromosome X ou Y chez Drosophila melanogaster.
Notre recherche vise à comprendre comment les cellules détectent, surveillent et régulent les multiples loci de l’ADN ribosomique dans leur génome. Plus précisément, nous visons à découvrir les mécanismes qui distinguent quels loci d’ADNr sont activement transcrits et comment ces loci sont régulés individuellement. Nous avons récemment découvert que la quantité d’ADNr dans une cellule peut changer au fil du temps, et que ce changement modifie les loci d’ADNr transcrits.
Nous comprenons maintenant que les cellules modifieront la transcription de leur ADNr en fonction de la quantité d’ADNr qu’elles possèdent. Cette découverte nous amène à nous demander comment les cellules savent combien d’AJR elles ont et comment elles déterminent quel locus d’ADNr elles préféreront exprimer. Notre laboratoire se concentre maintenant sur la compréhension du mécanisme utilisé par les cellules pour distinguer les différents loci de l’ADNr et détecter et réguler leur activité.
Au stéréomicroscope, disséquez la drosophile pour isoler les testicules dans du PBS sans RNase. Pour commencer, saisissez le milieu de l’abdomen avec une paire de pinces et l’extrémité de l’abdomen avec une autre paire pour séparer doucement l’animal. À l’aide d’une pince, transférez les testicules isolés de la boîte de dissection dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre contenant 0,5 millilitre de PBS sans RNase.
Aspirez le PBS et ajoutez un millilitre de solution de fixation. Placez l’échantillon sur un agitateur à nutation à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, aspirez la solution de fixation.
Ensuite, lavez l’échantillon deux fois avec un millilitre de PBS pendant cinq minutes chacune sur un agitateur à nutation. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez un millilitre d’éthanol à 70 % sans RNase et incubez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un agitateur à noix. Ensuite, aspirez l’éthanol et ajoutez un millilitre de tampon de lavage à l’échantillon.
Incuber l’échantillon à température ambiante sur un agitateur à nutation pendant trois minutes. Après cela, laissez le tube reposer à la verticale pendant deux minutes. Mélangez les sondes et les masques avec le tampon d’hybridation pour préparer un volume total de 100 microlitres par échantillon, comme indiqué ici.
Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution d’hybridation à l’échantillon après avoir aspiré le tampon de lavage. Appliquez un film transparent pour sceller les bords du tube. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière et incubez l’échantillon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant au moins 24 heures.
Sans aspirer la solution d’hybridation, ajoutez un millilitre de tampon de lavage à l’échantillon. Incuber l’échantillon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans l’obscurité. Une fois le tampon de lavage aspiré, ajoutez un millilitre de tampon de lavage frais à l’échantillon et incubez à nouveau.
À la fin de l’incubation, aspirez le tampon de lavage et ajoutez 50 microlitres de média de montage à l’échantillon. Sous un stéréomicroscope à dissection, utilisez une pipette pour transférer l’échantillon sur une lame de microscope. À l’aide d’une pince, disposez les testicules en ligne sur la lame du microscope pour faciliter l’identification de l’échantillon pendant l’imagerie.
Couvrez l’échantillon avec une lamelle et épongez les bords de la lamelle avec une lingette en mouchoir pour enlever l’excès de support de montage. Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles et laissez-les dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre au vernis à ongles de sécher. Des signaux d’ARNr ont été détectés dans le nucléole, apparaissant sous forme de régions poreuses DAPI dans le noyau, en particulier dans les cellules germinales avec de gros noyaux et nucléoles.
Des signaux faibles et non spécifiques ont été observés dans le cytoplasme dans des échantillons dépourvus de loci d’ARNr. Dans la plupart des cellules, les signaux de l’ARNr ont été détectés en exclusivité, ce qui indique la transcription de l’ARNr à partir du locus de l’ADNy. La co-expression de l’ARNx et de l’ARNyr a été observée dans les cellules germinales, les signaux fusionnant en un seul noyau ou se séparant en deux nucléoles.
Aperçu
Cette étude présente un protocole de fluorescence in situ sensible aux polymorphismes de nucléotides simples (SNP-FISH) permettant de distinguer les transcrits d'ARN ribosomique provenant des loci d'ADN ribosomique des chromosomes X et Y chez Drosophila melanogaster. La recherche vise à élucider les mécanismes par lesquels les cellules régulent et transcrivent différents loci d'ADN ribosomique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Génétique
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les cellules surveillent et régulent les loci d'ADN ribosomique au sein de leur génome.
- La compréhension de la régulation transcriptionnelle des loci d'ADN ribosomique est essentielle.
- Des découvertes récentes indiquent que la quantité d'ADN ribosomique peut évoluer au fil du temps.
- Les cellules adaptent leur transcription de l'ADN ribosomique en fonction de la quantité d'ADN ribosomique présente.
Objectif de l'étude
- Étudier la manière dont les cellules distinguent les différents loci d'ADNr.
- Comprendre la régulation de la transcription de l'ADNr en réponse aux conditions cellulaires.
- Explorer les mécanismes de préférence des loci d'ADNr lors de la transcription.
Méthodes utilisées
- Disséction de Drosophila pour isoler les testicules.
- Utilisation de PBS exempt de RNase pour la préparation des échantillons.
- Application de solutions de fixation et d'hybridation.
- Détection des signaux d'ARNr par microscopie à fluorescence.
Résultats principaux
- Les signaux d'ARNr ont été détectés dans le nucléole des cellules germinales.
- Une co-expression de X et d'ARNr Y a été observée dans certaines cellules.
- Des profils de transcription distincts ont été notés selon le locus d'ADNr.
- Des signaux faibles ont été trouvés dans les échantillons dépourvus de locus d'ARNr.
Conclusions
- La méthode SNP-FISH distingue efficacement les transcrits d'ARNr.
- Les cellules présentent une transcription sélective selon l'activité du locus rDNA.
- Cette étude améliore la compréhension de la régulation du rDNA chez Drosophila.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La discrimination de la transcription de l'ARN ribosomique spécifique à chaque locus est essentielle pour comprendre l'adaptation cellulaire et la biogenèse ribosomique dans les systèmes liés aux maladies. La FISH sensible aux SNP permet une visualisation directe de l'activité transcriptionnelle de l'ARNr à partir de locus génomiques distincts, soutenant ainsi la réduction des risques mécanistiques et la validation des cibles en phase de découverte précoce. Cette capacité renforce la fiabilité prédictive de la recherche translationnelle et du tri des portefeuilles dans des contextes génétiques complexes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'analyse de la régulation transcriptionnelle de l'ARNr au niveau de loci spécifiques dans des cellules individuelles.
- Permet la validation fonctionnelle des mécanismes régulateurs contrôlant la biogenèse ribosomale.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en distinguant les sources transcriptionnelles dans des systèmes hétérogènes.
- Améliore la fiabilité prédictive pour le classement par ordre de priorité des cibles génétiques affectant la fonction des ribosomes.
Développement de tests et criblage
- Offre un dosage validé permettant de quantifier la production d'ARNr spécifique à un locus dans divers types cellulaires.
- Permet la standardisation des mesures d'activité transcriptionnelle de l'ARNr dans différentes conditions expérimentales.
- Facilite la détection reproductible de changements transcriptionnels en réponse à des perturbations génétiques ou environnementales.
- Prépare les systèmes biologiques à un criblage en aval de modulateurs affectant l'activité du locus d'ADNr.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour la maladie dans lesquels le stress ribosomique ou le changement de locus est impliqué.
- Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique en suivant les modifications transcriptionnelles spécifiques aux locus.
- Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des données transcriptionnelles quantitatives et résolues au niveau du locus.
- Facilite le développement de biomarqueurs de la dysfonction ribosomique dans les études translationnelles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce méthode SNP-FISH s'intègre à la continuité découverte-préclinique en permettant une analyse transcriptionnelle spécifique du locus, soutenant à la fois la vérification d'hypothèses et le développement d'essais quantitatifs.
- Biologie de la découverte : Fournit des preuves directes de la régulation transcriptionnelle au niveau de locus spécifiques et permet la clarification des voies biologiques.
- Criblage : Fournit des mesures quantitatives et reproductibles de la transcription des ARr à partir de locus individuels.
- Analytique : Permet la comparaison statistique de l'activité transcriptionnelle entre différents locus d'ADNr dans diverses conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les modifications transcriptionnelles spécifiques à chaque locus et les modèles de maladies ou les stratégies de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme largement adaptable pour l'analyse transcriptionnelle résolue au niveau du locus, applicable à divers systèmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique en biologie ribosomale.
- Valeur opérationnelle : Standardise les tests transcriptionnels spécifiques à un locus pour assurer la reproductibilité et l'évolutivité.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'avancement ou d'abandon en clarifiant les mécanismes régulateurs et les sources transcriptionnelles.
- Impact sur le portefeuille : Permet de hiérarchiser les cibles et modèles selon un risque ajusté, en se basant sur des phénotypes transcriptionnels spécifiques à un locus.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en hybridation in situ en fluorescence et en analyse de cellules uniques.
- Suppose l'accès à une microscopie à fluorescence avancée et à une infrastructure d'analyse d'images.
- Exige une standardisation rigoureuse entre équipes des conceptions de sondes et des protocoles d'hybridation.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter une optimisation des sondes spécifique au locus.
- L'interprétation est limitée aux systèmes possédant des variants de séquence d'ARNr distinguables.
