Name: FISH sensible au polymorphisme mononucléotidique Détection de la transcription de l’ARN ribosomique spécifique du locus chez Drosophila melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Découvrez la méthode SNP-FISH pour distinguer les transcrits d'ARNr des loci X et Y chez Drosophila melanogaster. Cette technique permet d'étudier la régulation transcriptionnelle de l'ADNr in vivo.

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<ol><li>Baßler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eurokaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eurokaryotic ribosome assembly.</a> Ann Rev Biochem. 88 (1), 1-26 (2018).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Thermocycleur PTC Tempo 96</td><td>Bio Rad</td><td>12015382</td><td>Tout thermocycleur peut être utilisé</td></tr><tr><td>0,2 mL 8 bandes Tubes PCR à capuchon plat</td><td>VWR</td><td>89133-912</td><td>Tous les tubes compatibles peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Échelle d’ADN de 1 kb</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td>À utiliser lors de la vérification du séquençage PCR Taille de l’amplicon par électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation gradués de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Tout tube certifié libre de RNase fera</td></tr><tr><td>2 mM dNTP Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0241</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>1610743</td><td>Utilisé pour l’électrophorèse sur gel. N’importe quel tampon TAE peut être utilisé.</td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td></td><td></td><td>N’importe quel NaCl peut être utilisé ou préparé à partir de n’importe quelle source</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>97064-250</td><td>N’importe quel Agarose peut être utilisé</td></tr><tr><td>ApE - A plasmidique Logiciel d’édition</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ <tr><td>Vernis</td><td></td><td></td> à ongles transparent N’importe <td>quel vernis à ongles de n’importe quel détaillant peut être utilisé</td></tr><tr><td>Verre de couverture, n° 1 Épaisseur</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A38</td><td></td></tr><tr><td>Formamide déionisé</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9569627</td><td></td></tr><tr><td>Dextran Sulfate Sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8906-10G</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Forceps Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Utilisé pour la dissection d’échantillons</td></tr><tr><td>EDTA (0.5M), Ph 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1021</td><td>Tout produit comparable peut être utilisé</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>N’importe quel 200 proof L’éthanol peut être utilisé. Utilisé pour la dilution à 70 % d’éthanol pour la perméabilisation et le nettoyage dans des conditions sans RNASE</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Système horizontal d’électrophorèse en mini gel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-170</td><td>N’importe quel système d’électrophorèse sur gel peut être utilisé</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Test Staining Dish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71564</td><td>Utilisé pour la dissection d’échantillons</td></tr><tr><td>Agitateur à nutation</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BMSB3D1020</td><td>N’importe quel agitateur à nutation peut être utilisé</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>USA Scientific</td><td>3023-4526</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (10X) pH 7,4,</td><td>Technologies de vie</td> sans RNase <td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Percer 16 % de formaldéhyde (w/v),</td><td>Technologies de vie</td> sans méthanol<td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau de précision à usage général</td><td>Life Technologies</td><td>TSGP02</td><td>N’importe quel bain-marie peut être utilisé</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N’importe quel kit d’extraction de gel peut être utilisé</td></tr><tr><td>Solution de protéinase K recombinante (20 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2546</td><td>Tout produit comparable peut être utilisé</td></tr><tr><td>Sans Rnase UltraPure BSA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae ARNt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8759</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X), sans RNase</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Life Technologies</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7,5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td>Tout produit comparable peut être utilisé</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>Life Technologies</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Complexe de ribonucléoside vanadylique</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Média de montage VECTASHIELD avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VWR Superfrost Microscope Slide</td><td>VWR</td><td>48311-601</td><td></td></tr><tr><td>y[1]w[1] Drosophila melanogaster line</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>1495</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Zeiss LSM 980</td><td>Microscopie</td><td></td> Zeiss <td>Tout microscope confocal avec émission et détection compatibles peut être utilisé</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope Zeiss Stemi 2000-C et source lumineuse</td><td>Microscope Central</td><td>455053</td><td>Tout stéréomicroscope peut être utilisé</td></tr></tbody></table>

fish sensible au polymorphisme mononucléotidique détection de la transcription de l’arn ribosomique spécifique du locus chez drosophila melanogaster

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

Les résultats de séquençage du génotypage des SNP devraient permettre de détecter des différences SNP entre les loci de l’ADNr X et Y. Ces SNP sont détectés en évaluant directement les positions des SNP dans les chromatogrammes de séquençage (Figure 2). Le séquençage des échantillons féminins devrait avoir un seul signal de séquençage à la position SNP, indiquant l’homozygotie des SNP entre les deux chromosomes X (Figure 2A). Les résultats du séquençage des échantillons mâles devraient présenter un double pic à la position SNP (figure 2B). D’après le génotype du chromosome X déterminé à partir du séquençage de l’échantillon féminin, on déduit que la variante non-X est un SNP d’ADNr du chromosome Y (c’est-à-dire X = T, Y = C pour le séquençage du SNP 18S dans la figure 2). Alternativement, un seul pic de séquençage à une position SNP dans l’échantillon mâle indiquerait une homozygotie entre les loci d’ADNr mâles et femelles à cette position SNP, et cette position ne serait pas utilisable pour l’ARNr SNP-FISH.
Conformément au protocole pour SNP FISH, les échantillons peuvent être visualisés en les collant sur des lames et placés sous une lamelle scellée, suivie d’une microscopie confocale. À l’aide des sondes répertoriées dans le tableau 3, le signal d’ARNr dérivé de l’Y est détecté par l’émission d’Alexa Fluor 647 et le signal d’ARNr dérivé de l’X est détecté par l’émission d’Alexa Fluor 488. On s’attend à ce que des signaux d’ARNr soient observés dans le nucléole, qui peut être identifié comme le trou pauvre en DAPI dans le noyau (Figure 3A). Le nucléole est particulièrement facile à identifier dans les cellules germinales en raison de son grand noyau et de son nucléole (Figure 3A). Le signal faible peut généralement être trouvé dans le cytoplasme (Figure 3), mais il s’agit d’un signal non spécifique qui peut également être détecté dans des échantillons sans ARNr contenant un SNP complémentaire (c’est-à-dire, signal Y dans les cellules dépourvues d’ADNr Y ou signal X dans les cellules dépourvues d’ADNr X ; Figure 3B-C). De plus, un co-marquage artificiel de l’ARNr X et Y peut parfois être détecté dans le moyeux somatique, même dans des échantillons dépourvus de loci d’ADNr X ou Y (Figure 3B-C, flèches jaunes). Ainsi, seuls les signaux nucléaires doivent être utilisés pour évaluer la transcription spécifique au locus. La plupart des cellules, en particulier les cellules somatiques, ne devraient avoir qu’un signal d’ARNr Y, ce qui indique que l’ARNr est exclusivement transcrit à partir du locus de l’ADNr Y (Figure 3A, cercle pointillé jaune et flèche rouge)10,17. Cependant, la co-expression de l’ARNr X et Y est souvent détectée dans les cellules germinales, en particulier les cellules souches germinales13 (Figure 3A, cercles pointillés blancs). Les signaux d’ARNr X et Y dans les cellules co-exprimant peuvent être adjacents et former un seul nucléole (figure 3A, cellule supérieure) ou être séparés, formant deux nucléoles (figure 3A, cellule inférieure). Les exemples de la figure 3 sont tirés de l’utilisation d’ensembles de sondes ciblant seulement deux SNP (les deux SNP ITS1), démontrant que seulement deux SNP sont nécessaires pour l’ADNr SNP-FISH. Cependant, des signaux plus robustes sont observés lors de l’utilisation de sondes ciblant les quatre SNP13.
Les contrôles négatifs sont une inclusion importante pour ce test afin de confirmer que les sondes ne réagissent pas de manière croisée avec la mauvaise cible SNP, en particulier lors du premier dépannage de la méthode. Les contrôles négatifs du chromosome X comprennent toute condition qui n’a pas d’ADNr du chromosome X, comme les hommes porteurs d’un chromosome X avec une délétion de l’ADNr. On s’attend à ce que les témoins négatifs du chromosome X ne détectent que le signal de l’ARNr Y et aucun ARNr X (Figure 3B). Les contrôles négatifs du chromosome Y comprennent toute affection qui n’a pas d’ADNr du chromosome Y. Quelques exemples de ces conditions sont tous les tissus féminins XX, les tissus d’hommes sans chromosome Y ou les hommes hébergeant un chromosome Y avec une délétionde l’ADNr 15. On s’attend à ce que les témoins négatifs du chromosome Y ne détectent que le signal de l’ARNr X et n’aient aucun signal d’ARNr Y détectable (Figure 3C). Notez que ces commandes sont non seulement importantes pour déterminer la spécificité de la sonde, mais aussi pour déterminer l’arrière-plan ou les artefacts du signal. Toute nouvelle sonde ou condition de test qui fournit une spécificité dans de tels contrôles peut être utilisée avec précision pour détecter la transcription de l’ADNr spécifique au locus.
Différentes conditions génétiques, développementales ou environnementales peuvent modifier la probabilité que l’ADNr soit exclusivement transcrit à partir du locus de l’ADNr du chromosome Y13,17. La fréquence de transcription de l’ADNr à partir d’un seul locus ou de plusieurs locus peut être quantifiée et comparée directement entre les échantillons. Afin de comparer quantitativement les différences de transcription du locus de l’ADNr, chaque cellule doit être classée individuellement comme dominante Y, codominante ou dominante X. Les cellules ne sont classées comme dominantes Y et X que si seul ce signal respectif est détecté. Toute cellule avec des signaux d’ARNr Y et X est considérée comme codominante, même si un signal est beaucoup plus faible que l’autre. Ainsi, les cellules contenant des signaux X et Y très forts sont qualitativement considérées comme les mêmes cellules que les cellules avec des signaux Y forts et X faibles ou des signaux X forts et Y faibles. Le pourcentage total de toutes les cellules de tous les échantillons de chaque catégorie peut être comparé entre les échantillons par le test du chi carré. Bien que ce test fonctionne bien pour déterminer qualitativement si un locus d’ADNr particulier est transcrit ou non, nous n’avons pas observé d’évaluations cohérentes entre les échantillons lors de la quantification directe de l’intensité de fluorescence des signaux SNP-FISH individuels. Par conséquent, nous ne recommandons pas d’effectuer des évaluations quantitatives de l’intensité du signal FISH entre les échantillons ou de l’intensité relative des signaux X et Y de l’ADNr au sein d’une seule cellule. La source de cette incohérence dans l’intensité de la fluorescence n’est pas claire, bien qu’elle puisse être due à la liaison inefficace de sondes masquées qui ne se lient pas à tous les ARNr cibles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig01.jpg"> 
Figure 1 : Schéma de la méthode SNP-FISH. (A) Les sondes oligonucléotidiques antisens FISH traditionnelles réagissent de manière croisée avec des ARN non cibles qui ne diffèrent que par un nucléotide. (B) La méthode SNP-FISH utilise des oligonucléotides de masque complémentaires liés à la région 3' de la sonde oligonucléotidique. Le masque ne laisse que 10 nucléotides libres de se lier à la séquence cible. Une région de sonde non masquée ne se lie pas de manière stable à des séquences non cibles qui diffèrent d’un ou plusieurs nucléotides. Le masque se dissocie de la sonde après que la sonde se lie à la cible, ce qui permet une liaison stable entre la sonde et la cible. (C) Des sondes SNP appariées étiquetées différemment combinées à un masque commun lient spécifiquement des cibles qui diffèrent par un seul nucléotide sans réaction croisée. (D) Plusieurs sondes peuvent être regroupées pour marquer spécifiquement des haplotypes d’ARNr distincts. Quatre différences SNP ont été caractérisées entre les loci de l’ADNr X et Y dans la souche y1w1 de Drosophila melanogaster. Un SNP dans l’ARNr 18S, un dans l’ARNr 28S et deux dans la partie ITS1 du pré-ARNr. Les haplotypes d’ARNr spécifiques X et Y utilisés pour SNP-FISH sont affichés. Les sondes ciblant le variant X de l’ADNr au niveau des quatre SNP de l’ARNr sont conjuguées à un fluorophore commun (vert), et les sondes ciblant les variants de l’ADNr Y sont conjuguées à un fluorophore différent (magenta). Un masque commun est utilisé pour chaque SNP (quatre au total). La liaison d’une sonde spécifique au SNP à chaque position du SNP sur l’ARNr permet de marquer spécifiquement l’ARNr des loci X et Y de l’ADNr avec un maximum de quatre sondes oligonucléotidiques FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig02.jpg"> 
Figure 2 : Exemples de résultats de séquençage SNP de l’ADNr homozygote et hétérozygote. Exemple de chromatogrammes de séquençage à partir de 18S Séquençage SNP de l’ADN d’échantillons (A) féminins et (B) masculins. Position SNP 18S indiquée par un astérisque (*). Le signal unique de thymine (T) pour la position SNP dans l’échantillon femelle indique une thymine à la position SNP dans le locus de l’ADNr du chromosome X. Le double signal à la position SNP divisé entre thymine et cytosine (C) dans l’échantillon mâle indique une cytosine à la position SNP dans le locus de l’ADNr du chromosome Y (déduit en sachant que la thymine est au locus du chromosome X). Les résultats du séquençage ont été visualisés à l’aide d’ApE, un logiciel d’édition de plasmides19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig03.jpg"> 
Figure 3 : Exemples de résultats SNP-FISH chez la drosophile testicule en utilisant seulement deux ensembles de sondes SNP-FISH. Exemples de SNP FISH dans les testicules d’animaux avec (A) à la fois de l’ADNr X et Y, (B) seulement de l’ADNr Y, ou (C) seulement de l’ADNr X. Ces exemples n’ont utilisé que des ensembles de sondes marquant les deux SNP d’ARNr ITS1, démontrant que le SNP à ARNr FISH fonctionne avec aussi peu que deux SNP cibles. Les cellules germinales sont identifiées par leur grand noyau rond, et les cellules somatiques par leur noyau plus petit et moins rond. Les cellules souches germinales sont identifiées par leur position directement à côté du moyeu somatique, marquée d’un astérisque (*). Les cellules germinales qui transcrivent l’ADNr à partir des loci X et Y de l’ADNr sont identifiées par des signaux nucléaires FISH X et Y (cercles pointillés blancs, A-A''). Les cellules germinales qui transcrivent l’ADN à partir du seul locus de l’ADNr Y n’ont qu’un signal nucléaire Y FISH (cercle pointillé jaune). Les cellules somatiques exprimant uniquement Y sont marquées d’une flèche rouge. Un co-marquage artificiel des loci d’ADNr X et Y peut être observé dans le moyeu somatique (flèche jaune). La barre d’échelle est de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Séquence d’ARNr du locus du chromosome X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/Dm_45S_rRNA.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

FISH sensible au polymorphisme mononucléotidique Détection de la transcription de l’ARN ribosomique spécifique du locus chez Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

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Nous décrivons un protocole robuste et polyvalent pour l'analyse de l'architecture nucléaire par FISH d'ADN 3D à l'aide de sondes fluorescentes directement marqués.

Robuste FISH 3D DNA Utilisation des sondes directement marquées

PCR combinée à l'analyse de fusion à haute résolution (AGRH) est démontré comme une méthode rapide et efficace de déterminer le génotype du poisson zèbre.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Le but de cette publication est de visualiser et de discuter des étapes opérationnelles d'un protocole Northern Blot améliorée sur l'ARN extrait de Drosophila melanogaster embryons, des cellules et des tissus. Ce protocole est particulièrement utile pour la détection efficace de petites espèces d'ARN.

Amélioration de la détection du Nord Blot des petits ARN espèces en Drosophila melanogaster

La purification par affinité des ribosomes (TRAP) est capable de capturer la traduction spécifique du type cellulaire de l’ARNm. Nous rapportons ici le premier protocole TRAP dédié à l’isolement de l’ARNm dans des populations cellulaires rares d’embryons de drosophile.

TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Le protocole d’ARN décrit in situ hybridation permet la détection de l’ARN dans des embryons de drosophile entiers ou tissus disséqués. À l’aide de microplaques 96 puits et amplification de signal tyramide, transcriptions peuvent être détectées à un débit, sensibilité et haute résolution et à un coût relativement faible.

Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

Ici, nous présentons un protocole pour la visualisation, la détection, l'analyse et le suivi du trafic endogène d'ARNm dans la chambre d'oeufs de Melasophila melanogaster vivante utilisant des balises moléculaires, la microscopie confocale de disque spinning, et l'analyse open-source logiciel.

Visualisation et suivi des ARNm endogènes dans Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

L’hybridation in situ par fluorescence d’ARN à molécule unique (smFISH) est une méthode permettant de quantifier avec précision les niveaux et la localisation d’ARN spécifiques au niveau de la cellule unique. Ici, nous rapportons nos protocoles de laboratoire validés pour le traitement au banc humide, l’imagerie et l’analyse d’images pour la quantification unicellulaire d’ARN spécifiques.

Analyse unicellulaire d’allèles transcriptionnellement actifs par molécule unique FISH

Ici, nous présentons un protocole simplifié de marquage génétique endogène pour la drosophile, qui utilise une technique basée sur la PCR pour l’identification sans marqueur des modifications génétiques réussies, facilitant le développement de lignées d’inclusion stables.

Stratégie basée sur CRISPR en une étape pour le marquage des gènes endogènes chez Drosophila melanogaster

La drosophile est un modèle bien établi pour l’étude des molécules clés qui régulent la myogenèse. Cependant, les méthodes actuelles sont insuffisantes pour déterminer la dynamique transcriptionnelle de l’ARNm et la distribution spatiale au sein de la syncytia. Pour remédier à cette limitation, nous avons optimisé une méthode d’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN permettant la détection et la quantification des ARNm à l’échelle d’une seule molécule.

Étude de la dynamique transcriptionnelle musculaire à l’échelle d’une seule molécule chez la drosophile

L’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion (EASI-FISH) est une technique robuste qui combine la microscopie à expansion avec l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) pour détecter l’expression de plusieurs gènes dans les tissus épais. Ce protocole décrit les progrès récents de la méthode et son adaptation pour le marquage du système nerveux central intact de la drosophile.

Détection multiplex de l’expression génique dans le cerveau intact de la drosophile à l’aide de l’hybridation in situ par fluorescence itérative assistée par expansion

Découvrez la méthode SNP-FISH pour distinguer les transcrits d'ARNr des loci X et Y chez Drosophila melanogaster. Cette technique permet d'étudier la régulation transcriptionnelle de l'ADNr in vivo.

FISH sensible au polymorphisme mononucléotidique Détection de la transcription de l’ARN ribosomique spécifique du locus chez Drosophila melanogaster (Vidéo) | JoVE Journal

FISH sensible au polymorphisme mononucléotidique Détection de la transcription de l’ARN ribosomique spécifique du locus chez Drosophila melanogaster

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