FISH sensible au polymorphisme mononucléotidique Détection de la transcription de l’ARN ribosomique spécifique du locus chez Drosophila melanogaster

Notre recherche vise à comprendre comment les cellules détectent, surveillent et régulent les multiples loci de l’ADN ribosomique dans leur génome. Plus précisément, nous visons à découvrir les mécanismes qui distinguent quels loci d’ADNr sont activement transcrits et comment ces loci sont régulés individuellement. Nous avons récemment découvert que la quantité d’ADNr dans une cellule peut changer au fil du temps, et que ce changement modifie les loci d’ADNr transcrits.

Nous comprenons maintenant que les cellules modifieront la transcription de leur ADNr en fonction de la quantité d’ADNr qu’elles possèdent. Cette découverte nous amène à nous demander comment les cellules savent combien d’AJR elles ont et comment elles déterminent quel locus d’ADNr elles préféreront exprimer. Notre laboratoire se concentre maintenant sur la compréhension du mécanisme utilisé par les cellules pour distinguer les différents loci de l’ADNr et détecter et réguler leur activité.

Au stéréomicroscope, disséquez la drosophile pour isoler les testicules dans du PBS sans RNase. Pour commencer, saisissez le milieu de l’abdomen avec une paire de pinces et l’extrémité de l’abdomen avec une autre paire pour séparer doucement l’animal. À l’aide d’une pince, transférez les testicules isolés de la boîte de dissection dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre contenant 0,5 millilitre de PBS sans RNase.

Aspirez le PBS et ajoutez un millilitre de solution de fixation. Placez l’échantillon sur un agitateur à nutation à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, aspirez la solution de fixation.

Ensuite, lavez l’échantillon deux fois avec un millilitre de PBS pendant cinq minutes chacune sur un agitateur à nutation. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez un millilitre d’éthanol à 70 % sans RNase et incubez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un agitateur à noix. Ensuite, aspirez l’éthanol et ajoutez un millilitre de tampon de lavage à l’échantillon.

Incuber l’échantillon à température ambiante sur un agitateur à nutation pendant trois minutes. Après cela, laissez le tube reposer à la verticale pendant deux minutes. Mélangez les sondes et les masques avec le tampon d’hybridation pour préparer un volume total de 100 microlitres par échantillon, comme indiqué ici.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution d’hybridation à l’échantillon après avoir aspiré le tampon de lavage. Appliquez un film transparent pour sceller les bords du tube. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière et incubez l’échantillon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant au moins 24 heures.

Sans aspirer la solution d’hybridation, ajoutez un millilitre de tampon de lavage à l’échantillon. Incuber l’échantillon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans l’obscurité. Une fois le tampon de lavage aspiré, ajoutez un millilitre de tampon de lavage frais à l’échantillon et incubez à nouveau.

À la fin de l’incubation, aspirez le tampon de lavage et ajoutez 50 microlitres de média de montage à l’échantillon. Sous un stéréomicroscope à dissection, utilisez une pipette pour transférer l’échantillon sur une lame de microscope. À l’aide d’une pince, disposez les testicules en ligne sur la lame du microscope pour faciliter l’identification de l’échantillon pendant l’imagerie.

Couvrez l’échantillon avec une lamelle et épongez les bords de la lamelle avec une lingette en mouchoir pour enlever l’excès de support de montage. Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles et laissez-les dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre au vernis à ongles de sécher. Des signaux d’ARNr ont été détectés dans le nucléole, apparaissant sous forme de régions poreuses DAPI dans le noyau, en particulier dans les cellules germinales avec de gros noyaux et nucléoles.

Des signaux faibles et non spécifiques ont été observés dans le cytoplasme dans des échantillons dépourvus de loci d’ARNr. Dans la plupart des cellules, les signaux de l’ARNr ont été détectés en exclusivité, ce qui indique la transcription de l’ARNr à partir du locus de l’ADNy. La co-expression de l’ARNx et de l’ARNyr a été observée dans les cellules germinales, les signaux fusionnant en un seul noyau ou se séparant en deux nucléoles.