Administration d’anesthésiques volatils à des larves de poisson-zèbre pour l’observation comportementale

Nos recherches portent sur la pharmacologie anesthésique, ce qui comprend un intérêt pour les mécanismes anesthésiques ainsi que les mécanismes des effets secondaires anesthésiques. L’utilisation des larves de poisson-zèbre comme modèle comportemental pour étudier la pharmacologie anesthésique se développe rapidement et présente de nombreux avantages, notamment leur aptitude à être utilisées dans des expériences de dépistage à grande échelle. La comparaison des anesthésiques volatils et intraveineux reste difficile car l’administration d’anesthésiques volatils à des animaux non aquatiques est beaucoup plus facile que les anesthésiques intraveineux.

À l’inverse, les anesthésiques intraveineux sont plus facilement administrés aux animaux aquatiques que les anesthésiques volatils. Ce protocole fournit un moyen relativement peu coûteux et accessible d’administrer des anesthésiques volatils dans une chambre fermée pour effectuer des expériences comportementales chez les larves de poisson-zèbre. D’autres protocoles de cette nature nécessitent souvent une forme d’appareil personnalisé qui peut être coûteux ou difficilement accessible à ceux qui n’ont pas les moyens de créer ou d’acquérir ce type d’équipement.

Pour commencer, disposez une feuille de silicone de 0,5 millimètre sur une surface propre et plane. Inspectez les feuilles pour détecter tout pli et évitez-les dans la mesure du possible. Nettoyez les feuilles avec de l’alcool à 70 % pour enlever toute huile ou débris.

Lorsque la feuille est complètement sèche, utilisez un applicateur tel qu’un pinceau pour appliquer une fine couche uniforme d’apprêt adhésif sur la feuille de silicone. Une fois l’apprêt adhésif appliqué, alignez le ruban adhésif double face avec la feuille de silicone avec le support en papier vers le haut. Appliquez progressivement le ruban sur le silicone à l’aide d’un rouleau pour lisser la surface et éliminer les bulles d’air.

Réappliquez l’apprêt par petites sections au besoin et continuez l’application du ruban pendant que l’apprêt sèche en une à cinq secondes. Retournez la feuille de silicone pour travailler le côté silicone vers le haut afin de faciliter la visualisation et l’élimination des bulles d’air. Ensuite, coupez le silicone adhésif en bandes d’au moins 10 millimètres de large.

Assurez-vous que les bandes sont suffisamment longues pour couvrir au moins la largeur d’une rangée de la plaque de puits. Pour préparer les anesthésiques volatils, ajoutez un volume de solvant non volatil dans un flacon HPLC ou à scintillation, en assurant un espace de tête minimal une fois la dilution finale de l’anesthésique volatil ajoutée. Utilisez une seringue étanche au gaz Hamilton pour ajouter l’anesthésique volatil et scellez rapidement le flacon.

Mélangez les flacons par vortex ou sonication au besoin. Rangez-les temporairement pendant la préparation des assiettes de poisson-zèbre. Pour mettre en place l’expérience comportementale, transférez une larve de poisson-zèbre cinq jours après la fécondation dans une rangée sur deux d’une plaque de verre à 96 puits.

Retirez délicatement la solution E-three de chaque puits. À l’aide d’une pipette de transfert, remplissez chaque puits de la rangée avec la solution expérimentale. À l’aide des bandes de silicone adhésives, appuyez rapidement sur la bande vers le bas pour éviter la formation de bulles et le débordement des poissons dans les puits adjacents.

Appuyez ensuite fermement sur le dessus de la plaque pour vous assurer que chaque puits est scellé. Répétez le processus de scellement jusqu’à ce que la solution soit remplacée et que tous les puits de chaque rangée sur deux de la plaque soient scellés. Retournez doucement la plaque et vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air.

Placez la plaque dans l’unité d’observation du comportement avec l’adhésif silicone vers le bas, et effectuez l’expérience comportementale. Dans les puits scellés, la concentration de sévoflurane a montré une perte minimale sur trois heures, et l’isoflurane a montré une diminution de 4 % de la concentration. Aucun des deux anesthésiques n’a montré de perte significative au cours des 30 à 60 premières minutes.

La concentration efficace médiane pour le sévoflurane était de 62 micromolaires pour le mouvement spontané et de 126 micromolaires pour le mouvement provoqué, l’échelle étant nettement inférieure aux 240 micromolaires précédemment signalées, ce qui peut être dû à une amélioration de la création d’un joint étanche aux gaz avec cette méthode. Une différence significative dans le mouvement spontané a été observée entre les puits ouverts et scellés, a émergé au bout de deux heures, probablement en raison de l’épuisement de l’oxygène dans le puits, et constitue une limitation importante de cette technique.