Cellules stromales hétéromulticellulaires dans des cultures 3D sans échafaudage de cellules cancéreuses épithéliales pour stimuler l’invasion

Pour les patients diagnostiqués avec des tumeurs solides du sein ou du pancréas, il existe une forte corrélation entre les événements de progression de la maladie, comme les métastases ou la résistance au traitement, et les mauvais résultats. Les mécanismes moléculaires cellulaires qui régissent l’homéostasie et la fibrose tissulaires sont connus pour contrôler également la progression des tumeurs solides. Mon laboratoire s’intéresse à la compréhension de ces mécanismes afin que nous puissions mieux développer des thérapies et des mesures diagnostiques pour aider les patients.

L’un des principaux défis expérimentaux est qu’il existe un besoin critique de modèles de cancer 3D capables de capturer les interactions intercellulaires au cours des processus physiologiques et physiopathologiques, puis en comprenant ces interactions, des informations supplémentaires sur les maladies peuvent être comprises pour ensuite développer de nouvelles stratégies de traitement. Notre protocole fournira une méthode de culture cellulaire 3D rentable et reproductible qui réplique les caractéristiques du microenvironnement tissulaire in vivo. Notre protocole fournira des méthodes de culture cellulaire 3D sans échafaudage et basées sur un échafaudage faciles et rapides dans lesquelles nous pourrons quantifier les interactions cellulaires hétérogènes.

Nous avons découvert un moyen de formuler efficacement des cultures de sphéroïdes en 3D qui peuvent être utilisées avec des modèles sans échafaudage, mais qui peuvent également être fusionnées avec des systèmes basés sur des échafaudages pour mesurer l’invasion cellulaire et le comportement. Pour commencer, allumez la lumière ultraviolette pour désinfecter l’intérieur de l’enceinte de biosécurité pendant 15 minutes. Ouvrez le châssis de la fenêtre de l’enceinte de biosécurité pour stabiliser le flux d’air et allumez le système d’aspiration sous vide.

Nettoyez la surface intérieure de la hotte et la tubulure du système d’aspiration sous vide avec de l’éthanol à 70 %. Réchauffez le milieu de culture cellulaire, PBS, et 0,25 % de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius dans un bain de billes. Maintenant, examinez les cellules au microscope pour confirmer une confluence de 70 à 80 %.

À l’aide d’un aspirateur sous vide, aspirez et jetez le milieu de culture des cellules plaquées. Lavez le milieu restant une fois avec deux millilitres de PBS, puis aspirez et jetez le PBS après le lavage. Ensuite, à l’aide d’une micropipette, ajoutez un millilitre de trypsine dans la boîte de culture cellulaire et placez la plaque dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Maintenant, ajoutez un millilitre d’inhibiteur de trypsine de soja dans le PBS dans la plaque pour inactiver la trypsine. Pour disperser les amas de cellules, pipeter le mélange liquide à l’aide d’une micropipette P-1000. Récupérez la suspension cellulaire au bas de la plaque et transférez-la dans un tube conique de 15 millilitres.

Centrifugez le tube à 100 G pendant cinq minutes à température ambiante et jetez le surnageant à l’aide de l’aspirateur. Laissez les sondes fluorescentes moléculaires se réchauffer à température ambiante pendant 15 minutes dans un bain de billes tempéré à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une micropipette, remettre les cellules en suspension dans deux millilitres des solutions de colorant de suivi de cellules de travail respectives.

Incuber les tubes à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Après 30 minutes d’incubation, centrifugez les tubes à 100 G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, utilisez un aspirateur pour aspirer et jeter le surnageant.

Remettez complètement la pastille en suspension dans un millilitre de DMEM contenant 10 % de FBS à l’aide d’une micropipette. Maintenant, collectez 10 microlitres de suspension cellulaire et transférez-les dans un microtube contenant un volume égal de bleu de trypan. Après avoir mélangé les cellules, ajoutez 20 microlitres de la solution de trypan cellulaire à une lame de chambre de comptage de cellules.

Insérez la diapositive dans un compteur de cellules automatisé pour déterminer le numéro de cellule. Calculez le nombre total moyen de cellules vivantes à partir de deux lectures. Préparez des stocks de cellules de travail pour chaque type de cellule à une concentration de 6,67 fois 10 à la puissance trois cellules par millilitre, ce qui équivaut à 2 000 cellules par 300 microlitres.

À l’aide d’une micropipette, transférez le volume requis pour trois réplicats techniques plus une supplémentaire dans un microtube. Après avoir soigneusement mélangé à l’aide d’une pipette, transférez 300 microlitres de l’échantillon dans un puits doté d’une microplaque de 96 puits à fond en forme de U. Placez la plaque à 96 puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Imagez la croissance et la morphologie des sphéroïdes toutes les 24 heures, jusqu’à 96 heures, à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Allumez les appareils d’imagerie et d’incubation automatisés. Créez un nouveau protocole d’imagerie dans le gestionnaire de tâches du logiciel d’imagerie pour capturer la croissance sur 48 heures des sphéroïdes BT-474 co-cultivés avec des fibroblastes BJ-5ta et des cellules endothéliales EA.hy926 colorées avec le traqueur cellulaire colorant respectivement en bleu, orange et rouge foncé.

Remplissez un seau à glace de glace pour garder la solution d’extraction de la membrane sous-basale froide et placez la solution sur de la glace. À l’aide d’une pipette multicanaux, aspirez environ 170 microlitres de milieu de la boîte de culture. Munissez-vous d’une loupe et d’une mini boîte à lumière pour observer de près les petits sphéroïdes.

Placez la plaque sphérique à 96 puits sur la boîte à lumière et positionnez la loupe au-dessus de votre tête. Réglez une pipette P-200 sur 30 microlitres et collectez l’extrait de la membrane basale pour créer trois microgouttelettes. Assurez-vous que la plaque à 96 puits est plate et positionnez la pipette verticalement au-dessus du sphéroïde.

Maintenant, libérez la gouttelette sans toucher le fond du puits. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, superposez les sphéroïdes avec 50 microlitres supplémentaires de la solution d’extrait de membrane basale par puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, à l’aide d’une micropipette, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture cellulaire dans chaque puits. 72 heures après le placage, les cellules MCF-10A, MCF-10Ca1H et BT-474 co-cultivées avec EA.hy926 et THP-1 ou avec BJ5-ta et THP-1 ont montré une augmentation significative de la surface sphéroïde par rapport aux sphéroïdes épithéliales en monoculture. En revanche, les cellules MDA-MB-468 co-cultivées ont montré une diminution significative de la surface sphéroïde par rapport à la monoculture.

L’application d’un colorant de suivi cellulaire sur les cellules épithéliales tumorigènes BT-474 et les cellules stromales avant l’établissement des sphéroïdes a démontré que les cellules stromales, y compris EA.hy926 et BJ-5ta, formaient les structures bourgeonnantes au périmètre des sphéroïdes centraux BT-474. 24 heures après le placage, une membrane basale a été recouverte de cellules épithéliales tumorigènes BT-474 co-cultivées avec des cellules stromales, démontrant la formation de structures invasives.