Plate-forme d’imagerie optique multimodale pour l’étude du métabolisme cellulaire
6 juin 2025
À l’aide d’une plate-forme multimodale combinant des modalités d’imagerie optique sans marquage, nous avons développé un protocole pour visualiser et quantifier la dynamique cellulaire et le métabolisme. Grâce à l’imagerie par fluorescence multiphotonique, à la génération de secondes harmoniques et à la microscopie à diffusion Raman stimulée, nous pouvons générer une vue d’ensemble holistique de l’environnement cellulaire et moléculaire.
Notre recherche consiste à tirer parti de notre microscope multimodal pour mesurer les différences moléculaires et métaboliques dans plusieurs pathologies et visualiser leur hétérogénéité spatiale. L’approche multimodale de l’imagerie optique nous permet d’identifier les changements physiopathologiques sous divers angles. L’approche multimodale de la microscopie optique ne cesse d’élargir ses applications, notamment en milieu clinique, où le développement des micro-endoscopes a ouvert la voie à l’imagerie clinique.
Les défis expérimentaux actuels résident dans la complexité d’intégrer tout le matériel les uns aux autres, ce qui explique en partie pourquoi nous utilisons un système de microscope sur mesure. Grâce à l’utilisation de notre plateforme d’imagerie optique multimodale, nous avons fait des progrès significatifs dans l’étude des maladies bioorthogonales sans marquage, y compris la classification de différents sous-types de cancer du sein et l’analyse du métabolisme des lipides dans le cerveau de la drosophile et de la souris. Grâce à notre imagerie optique multimodale sans marquage, nous sommes en mesure de visualiser simultanément le métabolisme, la morphologie et la composition moléculaire, ce qui constitue un outil puissant pour étudier les maladies et le processus de vieillissement.
Pour commencer, réchauffez le laser et attendez environ 15 à 20 minutes. Mettez le boîtier de commande sous tension, puis le contrôleur à écran tactile, l’adaptateur secteur pour la télécommande laser principale et l’adaptateur secteur pour la télécommande laser secondaire, puis allumez le détecteur de photodiode au silicium et l’amplificateur de verrouillage. Installez le système laser avec un faisceau de pompe accordable de 780 nanomètres à 990 nanomètres, avec une largeur d’impulsion de cinq à six picosecondes et un taux de répétition de 80 mégahertz.
Le faisceau laser de Stokes doit avoir une longueur d’onde fixe de 1031 nanomètres, avec une impulsion de six picosecondes et un taux de répétition de 80 mégahertz. Assurez-vous que les faisceaux de la pompe et de l’aliment sont à faible puissance, au moins 20 milliwatts pour être visibles sur la plaque d’alignement. Appliquez de l’huile sur le condenseur d’huile à grande ouverture numérique.
Montez la lame du microscope sur le condenseur d’huile et placez une grosse gouttelette d’eau sur la lame du microscope pour l’objectif à eau 25X. Ajustez la platine Z pour régler la mise au point jusqu’à ce que l’image en fond clair de l’échantillon biologique soit visible sous l’objectif d’eau 25X. Commencez le processus d’imagerie dans le bon ordre pour éviter le photoblanchiment.
Pour basculer rapidement entre MPF et SHG, passez de la poutre de pompe à la poutre fixe. Sélectionnez la résolution de l’image de 512 x 512 pixels. Réglez le temps de séjour à huit microsecondes par pixel pour MPF et SHG, avec une image moyenne supérieure à trois.
Utilisez 40 microsecondes par pixel avec une image moyenne de deux pour la modalité SRS. Pour acquérir l’autofluorescence avec MPF, désactivez le faisceau laser stokes. Réglez le laser de la pompe à 800 nanomètres pour exciter le NADH et la flavine.
Acquérez le signal de la fibre de collagène à l’aide de SHG. Éteignez le faisceau laser de la pompe et n’utilisez le faisceau laser Stokes qu’à une puissance de 500 milliwatts. Obtenir la distribution spatiale des protéines et des lipides à l’aide de la SRS.
Gardez les deux faisceaux laser allumés et ajustez la fréquence du faisceau laser pour qu’elle corresponde au mode vibratoire spécifique de chaque molécule. Pour acquérir les ensembles de données d’images hyperspectrales SRS, sélectionnez le mode suite et réglez la plage de longueurs d’onde de 781,3 nanomètres à 806,5 nanomètres. Choisissez un nombre de pile d’au moins 60 et capturez la pile d’images hyperspectrales.
Enregistrez toutes les images des mêmes régions d’intérêt dans le même dossier et assurez-vous que le format de l’image est un fichier OIR d’Olympus. L’imagerie par autofluorescence et SRS a permis de capturer des informations métaboliques et structurelles dans des tissus pulmonaires humains. L’analyse ratiométrique du rapport redox optique et du rapport d’insaturation lipidique a fourni des distributions spatiales de l’activité métabolique et de la composition moléculaire dans le tissu pulmonaire humain.
La comparaison quantitative du stress oxydatif et de l’insaturation lipidique entre les tissus sains et tumoraux révèle des différences dans les états métaboliques.
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Aperçu
Cette étude présente une plateforme d'imagerie optique multimodale permettant la visualisation et la quantification de la dynamique cellulaire et du métabolisme. En utilisant diverses techniques d'imagerie, nous pouvons obtenir des informations sur l'environnement cellulaire et moléculaire dans différents contextes pathologiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Imagerie optique
Contexte
- La microscopie multimodale permet la mesure des différences moléculaires et métaboliques.
- Elle offre une vision globale des modifications physiopathologiques.
- Les applications s'étendent dans les milieux cliniques, notamment avec les micro-endoscopes.
- Les systèmes de microscope sur mesure permettent de relever les défis expérimentaux.
Objectif de l'étude
- Visualiser simultanément le métabolisme, la morphologie et la composition moléculaire.
- Étudier les maladies et le processus de vieillissement.
- Classer différents sous-types de cancer du sein.
Méthodes utilisées
- Microscopie à fluorescence multiphoton
- Microscopie de génération de seconde harmonique
- Microscopie de diffusion Raman stimulée
- Techniques d'imagerie bioorthogonales sans marqueur
Résultats principaux
- Des progrès significatifs dans la compréhension du métabolisme lipidique chez les organismes modèles.
- L'identification de l'hétérogénéité spatiale des dynamiques cellulaires.
- La classification des sous-types de cancer du sein à l'aide de techniques d'imagerie.
- Une visualisation améliorée des processus métaboliques dans le cerveau.
Conclusions
- L'approche multimodale est un outil puissant pour l'étude des maladies.
- Les techniques d'imagerie sans marquage fournissent des informations complètes sur les environnements cellulaires.
- Les applications futures pourraient améliorer davantage les capacités d'imagerie clinique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les plateformes d'imagerie optique multimodales intégrant les modalités de FPM, de GSH et de SRS permettent une quantification simultanée et sans marquage du métabolisme cellulaire, de la morphologie et de la composition moléculaire avec une résolution subcellulaire. Cette capacité répond à un besoin critique de données métaboliques et structurales riches en contenu et résolues spatialement dans les recherches fondamentales et translationnelles, renforçant ainsi la fiabilité prédictive des modèles de maladies et la réduction des risques mécanistiques. La capacité de la plateforme à coréférencer plusieurs paramètres fonctionnels provenant d'une même région biologique améliore la prise de décision stratégique et la progression ajustée au risque.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet la visualisation directe et la quantification de l'activité métabolique et de l'hétérogénéité moléculaire dans des systèmes pertinents pour les maladies.
- Prend en charge la réduction des risques mécanistiques en corrélant les états métaboliques avec des caractéristiques structurales et compositionnelles.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles grâce à une imagerie multiplexe sans marquage de cellules et de tissus vivants.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des résultats d'imagerie validés et reproductibles pour l'évaluation quantitative de biomarqueurs métaboliques et structuraux.
- Facilite la standardisation des tests en permettant l'acquisition simultanée de plusieurs modalités à partir d'une même région d'échantillon.
- Accélère la préparation au criblage en réduisant le besoin d'étiquettes exogènes et en minimisant la perturbation de l'échantillon.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats de l'imagerie métabolique et moléculaire avec la progression de la maladie et la réponse thérapeutique dans les modèles précliniques.
- Permet la cartographie spatiale de l'hétérogénéité métabolique liée à la biologie tumorale et à la neurodégénérescence.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en fournissant des lectures in situ et sans marquage.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette plateforme d'imagerie multimodale relie la découverte précoce, l'identification de candidats thérapeutiques et la recherche préclinique en fournissant des données multiplexées et quantitatives provenant de systèmes biologiques intacts.
- Découverte en biologie : Intègre la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en corrélant les données métaboliques, structurales et compositionnelles.
- Écrantage : Fournit des images quantitatives reproductibles adaptées à une analyse comparative entre différentes conditions.
- Analytique : Propose des mesures ratiométriques et résolues spatialement du stress oxydatif et de l'insaturation lipidique, permettant une analyse statistique robuste.
- Recherche translationnelle : Permet de relier les biomarqueurs d'imagerie aux états pathologiques et aux effets thérapeutiques dans les modèles expérimentaux.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre une capacité d'imagerie scalable et sans marquage, adaptable à divers modèles biologiques et domaines pathologiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles et des voies.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des flux de travail d'imagerie.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/non aller » et l'efficacité du capital en fournissant des données riches et multiplexées.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation et la progression, ajustées au risque, des programmes de découverte et précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie optique avancée et en intégration de matériel multimodal.
- Exige un instrument spécialisé, notamment des lasers accordables et des systèmes de détection synchronisés.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles d'imagerie et des pipelines d'analyse des données.
- L'adaptation à différents systèmes modèles peut nécessiter l'optimisation des paramètres d'imagerie et de la préparation des échantillons.
- La complexité de l'intégration du matériel et de la gestion des données peut limiter le débit dans certains contextes.
