Étude de la mort cellulaire programmée induite par les nanoparticules de cuivre chez les bactéries

Cette recherche porte sur l’efficacité bactéricide nanopartique du cuivre contre trois bactéries courantes cliniquement significatives. Il explore des cas tels que la génération de ROS et l’implication potentielle de la mort cellulaire programmée.

L’un des défis actuels consiste à obtenir des dénombrements cohérents des colonies. Je crois que cela découle de l’intervention. La modernisation cellulaire pendant la dilution des tiges simule le comptage avec l’emplacement par rapport au comptage plus expérimenté.

Notre groupe a été le premier à utiliser un modulateur cellulaire pour étudier les mécanismes bactéricides des nanoparticules de cuivre, révélant que la mort bactérienne implique des processus cellulaires tels que la génération de ROS et l’autophagie.

Le protocole répond à la nécessité d’une compréhension plus approfondie du mécanisme par lequel les nanoparticules de cuivre tuent les bactéries, en se concentrant particulièrement sur le domaine sous-exploré des voies de mort cellulaire programmée bactérienne.

En utilisant différents modulateurs cellulaires, nous avons confirmé que la mort bactérienne induite par les nanoparticules de cuivre implique l’autophagie et la surcharge de ROS et identifié des voies clés soutenues par des expériences fiables basées sur des triplets avec une simple conception

[Narrateur] Pour commencer, procurez-vous des nanopoudres de cuivre commerciales d’un diamètre de 25 nanomètres et de 60 à 80 nanomètres auprès d’un fournisseur commercial. Utilisez un millilitre d’un millimolaire SDS comme dispersant pour chaque taille de nanoparticule. Ensuite, dispersez les nanoparticules à l’aide d’un bain à ultrasons pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Ensuite, procurez-vous les souches d’Escherichia coli, d’Acinetobacter baumannii et de Staphylococcus aureus auprès des centres de ressources biologiques respectifs. Cultivez chaque bactérie dans 10 millilitres de bouillon LB dans des conditions aérobies à 37 degrés Celsius. Diluer les cultures bactériennes dans un milieu LB pour atteindre une densité optique d’environ 0,5 à 600 nanomètres. Utilisez maintenant des solutions mères de nanoparticules de cuivre pour préparer une gamme de concentrations entre zéro et 100 microgrammes par millilitre des deux tailles. Pipeter 500 microlitres de cultures bactériennes dans des tubes de microcentrifugation et centrifuger à 3 300 G pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir pipeté le surnageant, ajoutez différentes concentrations des nanoparticules des deux tailles dans chaque tube. Traitez les groupes témoins avec 500 microlitres de PBS comme contrôle négatif et 500 microlitres d’alcool à 70 % comme contrôle positif. Ensuite, incubez tous les échantillons en agitant à 200 tours par minute à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, laver les bactéries avec du PBS et les étaler sur des plaques de gélose LB. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, comptez les colonies sur chaque plaque pour tous les groupes de traitement. Traitez les bactéries avec cinq micromolaires SBI pendant deux heures, 0,5 micromolaire de nécrosulfonamide pendant une heure, 100 nanomolaires de wortmannin pendant 30 minutes ou 100 nanomolaires de Z-VAD pendant 30 minutes. Une fois le prétraitement terminé, centrifugez tous les tubes à 3 300 G pendant 10 minutes. Remettez ensuite en suspension la pastille dans 800 microlitres de PBS pour laver le modulateur de prétraitement. Répartissez les granulés remis en suspension. Centrifugez chaque tube, puis jetez le surnageant. Remettre les pastilles en suspension dans des mélanges de modulateurs de nanoparticules avant de les incuber avec agitation. Ajoutez maintenant 70 % d’éthanol et de PBS comme contrôles positifs et négatifs. Inclure des groupes témoins vierges traités avec des inhibiteurs, mais pas de nanoparticules. Après l’incubation, pipetez le réactif de viabilité cellulaire dans un rapport de volume de un à dix et incuberez. Après avoir centrifugé à nouveau les cultures, transférez les surnageants dans des plaques à 96 puits. Mesurez la fluorescence à une excitation de 560 nanomètres et une émission de 590 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques. Diluer les surnageants restants à 10 à la puissance moins cinq et 10 à la puissance moins quatre et étaler sur des plaques de gélose LB jusqu’à la culture. Comptez les colonies individuelles le lendemain. Pipeter les cultures bactériennes dans des tubes de microcentrifugation. Ensuite, exposez les cultures à une lumière ultraviolette de 405 nanomètres pendant trois heures. Ensuite, incubez les cultures à 45 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, incubez les bactéries à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Après le traitement par le froid, incubez les bactéries dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 30 minutes. Maintenez un groupe témoin à 37 degrés Celsius dans le bouillon LB. Traitez maintenant les bactéries avec des particules de 20 ou 60 nanomètres à des concentrations comprises entre un et 100 microgrammes par millilitre pendant 24 heures. Ensuite, lavez les bactéries traitées deux fois avec du PBS. Après la centrifugation, remettre en suspension les pastilles bactériennes dans une solution à cinq micromolaires de colorant de diacétate de dichlorodihydrofluorescéine 2',7'. Analysez l’intensité de la fluorescence à une émission de 520 ou 530 nanomètres. Le nombre de colonies d’Escherichia coli a été considérablement réduit de 20 nanoparticules de cuivre nanométriques à un microgramme par millilitre et de 60 nanoparticules de cuivre nanométriques à cinq microgrammes par millilitre. Staphylococcus aureus a montré des réductions significatives du nombre de colonies à toutes les concentrations des deux tailles de nanoparticules. Chez Acinetobacter baumannii, la réduction du nombre de colonies a nécessité cinq microgrammes par millilitre de nanoparticules de cuivre de 20 nanomètres et 10 microgrammes par millilitre de nanoparticules de cuivre de 60 nanomètres. Les traitements aux nanoparticules de cuivre ont induit la production d’espèces réactives de l’oxygène chez toutes les bactéries, les particules de 20 nanomètres montrant les fractions les plus élevées de cellules positives à des concentrations plus faibles. En revanche, les traitements de nanoparticules de cuivre de 60 nanomètres ont conduit à une génération cohérente d’espèces réactives de l’oxygène à toutes les concentrations. Le modulateur programmé de la mort cellulaire Z-VAD a augmenté la survie d’Escherichia coli traité avec les deux tailles de nanoparticules à des concentrations faibles à modérées. Le traitement par la NSA a amélioré la survie de Staphylococcus aureus à toutes les concentrations de nanoparticules de cuivre de 20 nanomètres. Acinetobacter baumannii a montré une meilleure viabilité avec le Z-VAD sous un, cinq et 10 microgrammes par millilitre d’exposition aux particules de cuivre de 20 et 60 nanomètres, tandis que la NSA a augmenté la viabilité à seulement 10 microgrammes par millilitre d’exposition aux nanoparticules de cuivre de 20 nanomètres.