Déplétion rapide des macrophages rénaux à l’aide d’un outil d’ablation cellulaire CD59/Intermedilysin humain

Nous utilisons l’oblation médiée par l’intermèlysine de la cellule humaine exprimant CD59 chez la souris pour étudier la régénération rénale des microphages, en nous concentrant sur la récupération des monocytes induite par les chimiokines et l’établissement de la niche de surveillance immunitaire après une lésion. Des développements récents dans notre domaine révèlent le mécanisme de régénération des macrophages rénaux, mettant en évidence une chimiokine spécifique qui recrute les macrophages et comment la surveillance immunitaire est rétablie après une lésion rénale aiguë. Nous combinons la cryogénétique inductible au tamoxifène, l’ablation de l’intermedilysine, la cytométrie en flux multiparamétrique et la microscopie intravitale pour ablater, suivre et visualiser les macrophages rénaux en temps réel.

Les principaux défis sont d’éviter l’inflammation systémique, de cibler uniquement les macrophages résidents et de mesurer la régénération rapide sans perturber le délicat mécicroenvironnement rénal. Nous avons montré que les monocytes restaurent 88 % des macrophages rénaux dans les sept jours suivant l’ablation, un processus qui dépend de manière critique de l’axe de signalisation CX3 CR1, CX3 CL1. Pour commencer, préchauffez l’huile de maïs à 42 degrés Celsius.

Dissoudre 100 milligrammes de tamoxifène dans cinq millilitres d’huile de maïs préchauffée pour préparer une solution mère avec une concentration de 20 milligrammes par millilitre. Administrer du tamoxifène par voie intrapéritonéale à des souris mâles âgées de 10 à 12 semaines à une dose de 100 microgrammes par gramme de poids corporel. Après 15 jours, injectez une dose intraveineuse unique d’interméthalysine chez les souris à une dose de 120 nanogrammes par gramme de poids corporel.

Surveiller et confirmer l’ablation des macrophages résidents et la régénération subséquente en effectuant une cytométrie en flux à un, trois et sept jours après l’administration d’intermédialysine. Pour le prélèvement de reins, utilisez des pinces fines et des ciseaux pour faire une incision horizontale dans la région abdominale inférieure d’une souris euthanasiée. Prolongez l’incision verticalement le long de la ligne médiane jusqu’à juste en dessous de la cage thoracique ou du sternum.

Rétractez doucement la peau et le muscle pour découvrir la cavité thoracique. Ouvrez l’oreillette droite pour permettre au sang de s’écouler de la circulation. Insérez une aiguille de calibre 21 à 23 dans le ventricule gauche.

Commencer la perfusion avec 10 à 20 millilitres de PBS froid pour évacuer le sang. Continuez la perfusion jusqu’à ce que les reins apparaissent pâles, indiquant une clairance sanguine efficace. Placez les reins contre la paroi dorsale du corps et séparez-les doucement des tissus environnants à l’aide de pinces et de ciseaux.

Excisez les capsules rénales et placez immédiatement les reins dans du PBS froid pour éviter la dégradation. Préparez 100 millilitres de cocktail d’enzymes de digestion en mélangeant du HBSS sans calcium ni magnésium, de la collagénase IV et de la DNase I.Préparez la solution enzymatique fraîche et conservez-la sur de la glace jusqu’à utilisation. À l’aide de ciseaux stériles, hachez les reins en minuscules fragments dans une boîte de Pétri contenant cinq millilitres de HBSS.

Transférez le tissu rénal haché dans des tubes de 15 millilitres contenant 10 millilitres de la solution enzymatique préparée. Incuber maintenant les tubes à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec une légère agitation pour dissocier les tissus. Triturez doucement le tissu à l’aide d’une pipette ou d’un piston de seringue pour briser davantage les amas cellulaires.

Éliminez les débris en faisant passer la suspension cellulaire à travers une crépine de cellule de 40 micromètres. Centrifuger la suspension cellulaire à 700 G pendant 10 minutes à 18 degrés Celsius. Ensuite, décantez soigneusement le tampon.

Remettre la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon de lyse avant de l’incuber à température ambiante pendant cinq minutes pour lyser les globules rouges. Ajoutez du PBS pour laver les cellules et retirez le tampon de lyse. Maintenez la suspension unicellulaire résultante sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ultérieurement.

Pour la centrifugation à gradient de densité, remettez d’abord en suspension la pastille de cellule dans 10 millilitres de solution à gradient de densité de 30 %. Superposez-le soigneusement sur trois millilitres de solution à gradient de densité de 70 % dans un tube à centrifuger. Centrifuger le gradient à 500 G pendant 30 minutes sans appliquer de pause.

Après la centrifugation, prélevez soigneusement la couche d’interface entre les solutions 30 % et 70 %. Lavez deux fois les cellules collectées avec 10 millilitres de PBS et centrifugez chaque lavage à 500 G pendant 10 minutes. Remettez en suspension la pastille de cellule finale dans un millilitre de tampon FACS dans un tube de 1,5 millilitre.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre sous un microscope à fond clair et ajustez la concentration cellulaire à deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Granulez les cellules dans des tubes de 1,5 millilitre en les centrifugant à 650 G pendant cinq minutes, et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon FACS. Ajouter l’anticorps anti-CD 16 ou 32 à une dilution de un à 200 pour bloquer la liaison du récepteur FC non spécifique.

Après avoir incubé les cellules pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, colorez les cellules avec un colorant aqua vivant/mort et un cocktail d’anticorps préconjugués, y compris CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE et F4/80 BV 605. Ajoutez le cocktail d’anticorps directement dans la suspension cellulaire. Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pour protéger les fluorophores.

Ensuite, lavez les cellules deux fois avec le tampon FACS. Fixez les cellules dans 1 % de paraformaldéhyde pendant 30 minutes sur de la glace. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un tampon FACS pour éliminer le fixateur résiduel.

Acquérir des cellules colorées et fixées à l’aide d’un cytomètre en flux. Analysez les données à l’aide du logiciel. Identifiez les macrophages et les microglies résidant dans les reins et autres tissus à l’aide des marqueurs CD45, CD11B et F4/80.

Effectuez un premier contrôle pour sélectionner des cellules vivantes à l’aide de profils de diffusion avant et latérale. Éliminez les doublets en utilisant la zone de diffusion vers l’avant plutôt que le gate en hauteur. Excluez les cellules mortes à l’aide du colorant de viabilité.

Enrichir les cellules immunitaires en bloquant les populations CD45 positives. Définir les macrophages résidents du rein comme des cellules CD11b+F4/80hi à l’intérieur d’une porte CD45 positive, comme le montre la stratégie de déclenchement. Définir les populations de microglies en tant que cellules intermédiaires CD11b+CD45 et effectuer l’analyse finale.

Une seule bande protéique proéminente a été observée près de 54 kilodaltons dans le gel de la page SDS, confirmant la pureté et le poids moléculaire attendu de l’intermédilysine recombinante. L’intermédilysine purifiée a montré une forte activité hémolytique de manière dose-dépendante, atteignant une lyse de 50 % des globules rouges à 7,24 nanogrammes par millilitre, et une lyse presque complète à 650 nanogrammes par millilitre. L’analyse par cytométrie en flux a confirmé une déplétion réussie et sélective des macrophages rénaux chez des souris humaines cré-R inductibles un jour après l’administration d’intermédilysine, sans épuisement chez les souris témoins.

Les macrophages rénaux ont commencé à se repeupler le troisième jour et ont retrouvé environ 88 % de leur population d’origine le septième jour. Seulement 5 % des macrophages rénaux nouvellement régénérés exprimaient des CD59 humains au septième jour, ce qui indique que la repopulation s’est principalement produite par le recrutement de monocytes plutôt que par prolifération in situ.