Tests comportementaux pour la manipulation optogénétique des circuits neuronaux chez Drosophila melanogaster

Notre recherche utilise des outils optogénétiques pour étudier comment les circuits neuronaux de Drosophila melanogaster régissent les comportements, comme la thermotaxie et la gestation. En contrôlant des neurones spécifiques avec de la lumière, nous visons à comprendre comment ces circuits entraînent des réponses sensorielles et influencent la prise de décision avec une grande précision. L’optogénétique est une technologie précieuse en neurosciences, offrant un contrôle précis de l’activité neuronale à l’aide de la lumière.

Chez Drosophila melanogaster, des outils tels que CsChrimson et GtACR2 permettent une activation et une inhibition ciblées des neurones. Ces outils permettent aux chercheurs de manipuler les circuits neuronaux, d’étudier le comportement et d’explorer les réponses des capteurs avec une grande spécificité. Notre protocole offre une approche simple, rentable et reproductible de la manipulation optogénétique chez la drosophile.

Il utilise des matériaux disponibles dans le commerce, ce qui le rend accessible dans les laboratoires et les salles de classe aux ressources limitées. Les méthodes sont également très adaptables, ce qui permet d’étudier les comportements d’attraction et d’évitement avec un minimum de défis techniques. Pour commencer, obtenez des mouches drosophiles mâles et femelles, exprimant GtACR2 dans des cellules chauffantes.

Alignez deux plaques d’acier sur des plaques chauffantes séparées de sorte que leurs bords se rejoignent. Placez un protecteur de feuille de plastique sur le dessus et fixez-le avec du ruban adhésif pour minimiser les mouvements. Maintenant, placez une feuille de papier blanc sur le protecteur de feuille pour réduire les signaux de bruit de fond, et placez un couvercle en plastique transparent sur le papier blanc.

Ensuite, découpez un trou dans le fond d’une boîte en mousse de polystyrène pour accueillir l’appareil photo et la lumière bleue à environ 12 centimètres au-dessus de la surface expérimentale. Positionnez la caméra et la lumière bleue de manière à minimiser l’éblouissement, tout en assurant l’activation. Réglez l’appareil photo pour qu’il enregistre avec un laps de temps d’une seconde, un champ étroit et une résolution de 4 000 x 3 000 pixels.

Ajustez les paramètres de la plaque chauffante pour maintenir une température de surface de plus ou moins un degré Celsius et de 31 plus ou moins un degré Celsius sur les plaques d’acier respectives. Surveillez la température des plaques d’acier à l’aide d’une sonde de température de surface avant et après chaque essai. Ensuite, placez le couvercle en plastique sur la plaque d’acier à 25 degrés Celsius.

Maintenant, à l’aide d’un aspirateur de mouches, libérez doucement une seule mouche sous le couvercle. Positionnez la boîte au-dessus de la zone d’expérimentation pour créer une lumière tamisée en dessous de 10 lux, et laissez la mouche s’acclimater pendant une minute. Après la période d’acclimatation, soulevez la boîte et ajustez rapidement le couvercle en plastique de sorte que le centre du couvercle s’aligne avec la limite de la plaque d’acier.

Lancez l’essai, allumez la caméra et la lumière bleue à 20 kilolux. Capturez l’activité des mouches pendant deux minutes. Au bout de deux minutes, éteignez l’appareil photo et allumez-le.

Jetez les mouches à l’aide de l’aspirateur. Anesthésie les mouches mâles et femelles affamées exprimant CsChrimson dans les neurones récepteurs du goût sucré sur la glace. Appliquez sept à 10 petits points de colle sur une lame de verre.

Positionnez une braguette ventrale vers le haut sur chaque point de colle, en vous assurant que le thorax et les ailes entrent en contact avec la colle pour minimiser les mouvements. Déployez les ailes de chaque côté pour augmenter la surface adhésive. Placez des serviettes en papier humides dans une boîte humide et transférez les lames dans la boîte.

Après deux heures de récupération, placez la lame sous le microscope. Utilisez une seringue pour délivrer une gouttelette d’eau afin de rassasier les mouches, évitant ainsi les extensions de trompe induites par la soif. Tenez manuellement un pointeur laser rouge et faites briller une lumière rouge sur la trompe ou la tête d’une seule mouche à 700 lux.

Observez la réponse d’extension du proboscis au microscope dans une fenêtre de 30 secondes. Après avoir testé l’extension du proboscis induite par la lumière, examinez la réponse à 4 % de saccharose. Expulsez une gouttelette de saccharose à l’extrémité de l’aiguille de la seringue et approchez-la de la trompe de la mouche.

Tout d’abord, assemblez le labyrinthe de mouches pour l’expérience. Dans l’obscurité ou dans des conditions de faible luminosité, placez 10 mouches mâles et 10 mouches femelles exprimant CsChrimson dans le tube de chargement et connectez-le à la chambre de retenue. Inclinez l’élévateur et tapotez doucement le tube pour déplacer les mouches dans la chambre de rétention.

Après avoir transféré les mouches dans la chambre de rétention, utilisez l’élévateur pour les descendre entre le tube de chargement et les trous du tube d’essai. Retirez ensuite le tube de chargement. Placez le labyrinthe à environ 13 centimètres de la source de lumière rouge de 1 000 milliampères sans allumer la lumière.

Abaissez l’élévateur jusqu’à ce que la chambre de maintien s’aligne avec les trous des tubes d’essai, permettant aux mouches de se déplacer librement entre les tubes d’essai enveloppés d’aluminium et les tubes d’essai découverts. Simultanément, allumez la lumière rouge à environ 40 kilolux pour activer CsChrimson. Laissez les mouches choisir entre le tube exposé à la lumière rouge et le tube ombragé pendant une minute.

Au bout d’une minute, soulevez l’élévateur entre le tube de chargement et les trous du tube d’essai. Retirez les mouches de chaque tube. Comptez-les et notez les numéros.

Nettoyez l’élévateur à mouches et le labyrinthe à mouches avec de l’eau distillée après chaque essai. Dans le test de préférence positionnelle, optogénétique, thermotactique et en lumière bleue, les mouches ont évité le côté de 31 degrés Celsius dans les conditions de contrôle, tandis qu’en lumière bleue avec supplémentation en ATR, les mouches n’ont montré aucune préférence entre 25 et 31 degrés Celsius, indiquant une inhibition des neurones HC via l’activation de GtACR2. Dans des conditions de contrôle, les mouches ont montré une réponse minimale d’extension du proboscis, tandis que l’activation de la lumière rouge avec la supplémentation en ATR a entraîné une extension significative du proboscis, démontrant l’activation des neurones sensibles au sucré par CsChrimson.

Dans l’essai optogénétique à la lumière rouge et au labyrinthe de mouches, les groupes témoins n’ont montré aucune préférence, tandis que l’activation de la lumière rouge avec la supplémentation en ATR a amené les mouches à éviter le tube découvert, indiquant une activation des neurones à détection amère par CsChrimson.