Identification de la microglie et des macrophages infiltrants périphériques dans la moelle épinière lésée à l’aide de la cytométrie en flux

Notre recherche identifie les microglies et les macrophages infiltrants dans les lésions de la moelle épinière afin de clarifier leurs rôles dans la neuroinflammation à l’aide d’une cytométrie en flux optimisée. La cytométrie en flux et la centrifugation à gradient de densité sont essentielles pour isoler et phénotyper les cellules immunitaires du système nerveux central avec une spécificité et une efficacité élevées. Distinguer les microglies et les macrophages morphologiquement similaires, minimiser la perte de cellules pendant l’isolement, et la microspécificité inférieure dans les microenvironnements de lésions dynamiques restent des obstacles majeurs. Les méthodes existantes ne parviennent pas à séparer de manière fiable les microglies résidentes des macrophages infiltrants. Notre approche basée sur les marqueurs résout cette limitation critique dans les études sur les lésions de la moelle épinière.

[Présentateur] Pour commencer, analysez le tube de contrôle des isotypes à l’aide du cytomètre en flux avec le logiciel compatible. Ajustez les tensions de diffusion directe et de diffusion latérale pour positionner la population de cellules dans une plage appropriée. Configurez deux graphiques supplémentaires, l’un avec IgG APC sur l’axe X et IgG PE sur l’axe Y, un autre avec IgG-FITC sur l’axe X et IgG APC-Cy7 sur l’axe Y. Ajustez ensuite les tensions des canaux de fluorescence pour les IgG APC, IgG PE, IgG FITC et IgG APC-Cy7 pour positionner la population cellulaire dans le 10 à la puissance trois de la région double négative. Après avoir confirmé les tensions optimisées à l’aide du tube de commande d’isotype, conservez tous les réglages. Procédez à l’analyse des tubes expérimentaux colorés par des anticorps. Établissez un graphique avec CD11b PE sur l’axe des X et une diffusion latérale sur l’axe des Y. Configurez un autre graphique avec CD68 FITC et CCR7 APC-Cy7. En utilisant la commande d’isotype comme référence, délimitez la région CD11b positive et définissez-la comme la porte P1. Sélectionnez le graphique CD68 FITC et CCR7 APC-Cy7. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour ouvrir Afficher la population et attribuez la colonne F4 à P1. Après avoir acquis les données, ajustez la compensation de fluorescence si nécessaire. Analyser et consigner le pourcentage de populations de cellules CD11b CD68 CCR7 positives et CD11b CD68 positives CCR7 négatives. Commencez à analyser les tubes expérimentaux à l’aide des paramètres de tension du tube de contrôle d’isotype. Etablir un graphique avec CD45 APC et CD11b PE. Ensuite, configurez deux graphiques avec CD68 FITC et CCR7 APC-Cy7. Acquérez 50 000 événements par échantillon et ajustez la compensation de fluorescence après la collecte des données. Dans les graphiques pseudocolorimétriques de CD45 et CD11b, identifiez et analysez les régions pour les cellules CD11b positives, CD45 négatives faibles et CD11b positives CD45 élevées. Analysez ensuite les populations CCR7 positives CD68 positives et CCR7 négatives CD68 positives dans chaque région. Intégrez toutes les analyses pour déterminer le pourcentage de microglies et de macrophages de type M1 et M2 dans les régions définies. Lancez le logiciel d’analyse par cytométrie en flux. Faites glisser les fichiers d’expérience de cytométrie en flux dans la section Tous les échantillons de l’interface. Double-cliquez sur l’échantillon de contrôle d’isotype pour ouvrir un graphique à points bidimensionnel. Sélectionnez FSCA pour l’axe X et SSCA pour l’axe Y, puis cliquez sur le bouton de porte rectangulaire et utilisez-le pour sélectionner la zone excluant les débris cellulaires. Double-cliquez sur la zone fermée pour ouvrir un nouveau tracé d’histogramme. Sélectionnez ensuite FITC pour l’axe X et histogramme pour l’axe Y. Cliquez sur le bouton de la porte de région pour définir le seuil entre les signaux fluorescents négatifs et positifs. Pour chacun des quatre anticorps fluorescents, déterminez le seuil entre les signaux négatifs et positifs à l’aide de l’échantillon de contrôle isotype. Changez séquentiellement le fluorochrome de l’axe X en PE-APC et APC-Cy7 tout en conservant l’histogramme de l’axe Y. Utilisez l’outil de porte de région dans chaque histogramme pour finaliser les portes permettant de distinguer les signaux fluorescents négatifs et positifs pour les quatre anticorps. Ensuite, double-cliquez sur l’échantillon expérimental pour ouvrir un graphique à points. Sélectionnez FSCA pour l’axe X et SSCA pour l’axe Y, cliquez sur le bouton de porte rectangulaire pour bloquer la population après avoir retiré les débris. Double-cliquez sur la région fermée pour ouvrir un nouveau graphique à points. Sélectionnez CD11b PE pour l’axe X et SSCA pour l’axe Y. Cliquez sur le bouton de porte rectangulaire et utilisez le seuil PE de la commande d’isotype pour définir la porte CD11b positive. Double-cliquez maintenant sur la région CD11b positive pour ouvrir un autre diagramme à points, sélectionnez CD68 FITC pour l’axe X et CCR7 APC-Cy7 pour l’axe Y. Cliquez sur le bouton crossgate et utilisez les seuils FITC et APC-Cy7 dérivés de l’isotype pour classer les cellules en types de type M1 et de type M2. La proportion de cellules CD45 CD11b positives CD68 positives pour CCR7 a augmenté de façon significative dans le groupe des lésions de la moelle épinière par rapport au groupe des personnes fictives, et le traitement par CRID3 n’a pas modifié ce niveau. La proportion de cellules CD45 négatives à CD11b positives et à CD68 positives pour le CCR7 était significativement plus élevée dans le groupe des véhicules de la LME que dans le groupe placebo, et a été significativement réduite après le traitement par CRID3. Les proportions de cellules CD11b positives CD68 positives pour CCR7 ont augmenté de façon significative dans le groupe des véhicules de la LME par rapport au groupe placebo et ont diminué de façon significative après le traitement par CRID3. CD11b positif, CD68 positif, CCR7 négatif et CD45 négatif, CD11b positif, faible, CD68b positif : les proportions de CCR7 négatifs ont considérablement diminué dans les deux groupes de véhicules de lésion médullaire par rapport aux groupes placebo et ont augmenté après le traitement par CRID3.