Name: Cell-free dot blot en tant que plateforme d’immunodosage pratique et adaptable pour la détection de la réponse anticorps dans les sérums humains et animaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Découvrez la technique cell-free dot blot pour la détection des anticorps dans les sérums humains et animaux. Cette plateforme d'immunoessai accessible et abordable permet une adaptation rapide aux épidémies émergentes.

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<ol><li>Carter, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+techniques+and+test+development+for+COVID-19+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis.</a> ACS Cent Sci. 6, 591-605 (2020).</li>
<li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nat Med. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li>
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<li>Gong, F., Wei, H., Li, Q., Liu, L., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+comparison+of+serological+methods+for+COVID-19+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and comparison of serological methods for COVID-19 diagnosis.</a> Front Mol Biosci. 8, 682405(2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Échelle d’ADN de 1 kb</td><td>NEB</td><td>N3232</td><td>Utilisé comme marqueur de taille pour les gels d’agarose</td></tr><tr><td>20 Acides aminés</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td>Un composant de la réaction acellulaire Solution B</td></tr><tr><td>Biopoinçon de biopsie de 2 mm&nbsp ;</td><td>Integra Miltex&nbsp ;</td><td>33-31-P/25</td><td>Pour la préparation de la grille maîtresse CFDB</td></tr><tr><td>Chlorhydrate d’acide 5-aminolévulinique&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>Précurseur de l’hème pour l’induction de la poudre d’agarose SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td></td><td>BioShop</td><td>AGA002</td><td>Pour l’analyse électrophorétique de l’anticorps</td></tr><tr><td>anti-ADN anti-SARS-CoV2-Nucleocapside</td><td>Sinobiological</td><td>40588-T62</td><td>Pour la détection WB de l’antigène NP produit sans cellule</td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc&nbsp ; XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>Instrument imageur gel</td></tr><tr><td>Concentrateurs centrifuges</td><td>Cytiva</td><td>28-9323-60</td><td>Pour la concentration et l’échange tampon de protéines</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628257</td><td>Pour la récolte de la culture bactérienne</td></tr><tr><td>Coenzyme&nbsp ; Un hydrate de sel de sodium (CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144</td><td>Un composant de la réaction acellulaire Solution Un</td></tr><tr><td>étalon protéique pré-coloré en couleur (large gamme)</td><td>NEB</td><td>P7719</td><td>Utilisé comme marqueur de taille pour les gels SDS-PAGE Panneau de</td></tr><tr><td>sérum Covid-19</td><td>RayBiotech</td><td>CoV-PosSet</td><td>Sérums pré-caractérisés pour la vérification et l’optimisation des réactifs/conditions</td></tr> <tr><td>CFDBD-(&minus ;)-Sel disodique de l’acide 3-phosphoglycérique (3-PGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>Composant A de la réaction acellulaire Solution B</td></tr><tr><td>Dithiothréitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Composant des tampons</td></tr><tr><td>E. coli 5-alpha</td><td>NEB</td><td>C2987&nbsp ;</td><td>pour la préparation de plasmides</td></tr><tr><td>E. coli BL21&nbsp ;</td><td>ONÉ</td><td>C2530</td><td>Pour la préparation de lysats acellulaires</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>NEB</td><td>C2527&nbsp ;</td><td>Pour l’expression de SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Comprimé inhibiteur de protéase sans EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>un composant du tampon de lyse E. coli</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp ; Nouveau-Brunswick ; Innova 43/43R Incubateur Agitateur</td><td>Eppendorf</td><td>EPM1320</td><td>Incubateur pour la croissance de cellules E. coli pour l’expression de protéines et la préparation de lysats acellulaires</td></tr><tr><td>Acide folinique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47612</td><td>Un composant de la réaction acellulaire Solution A</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td>Composant de SpyCatcher2-Apex2 tampon de stockage</td></tr><tr><td>Chlorure d’hémine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039&nbsp ;</td><td>Pour la supplémentation hémique de SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène 30 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Pour la fabrication du réactif ECL</td></tr><tr><td>Logiciel de laboratoire d’image</td><td>Bio-Rad</td><td>1709690</td><td>pour l’instrument d’imagerie ChemiDoc gel&nbsp ;</td></tr><tr><td>Isopropyl-b-D-1-thiogalactopyranoside&nbsp ;</td><td>Bioshop</td><td>IPT001</td><td>Pour l’induction de SpyCatcher2-Apex2 expressikon</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Pour la préparation de SpyCatcher2-Apex2 culture bactérienne</td></tr><tr><td>LB agar</td><td>BioShop</td><td>LBL406</td><td>Pour la croissance d’E. coli</td></tr><tr><td>LB bouillon</td><td>BioShop</td><td>LBL407</td><td>Pour la croissance d’E. coli</td></tr><tr><td>luminol&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4685</td><td>Pour la fabrication du réactif ECL</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Pour la lyse des cellules bactériennes</td></tr><tr><td>Acétate de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td>Un composant de la réaction acellulaire Solution B</td></tr><tr><td>NEBExpress Ni résine&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>S1428S</td><td>Pour la purification du lait écrémé en poudre SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td></td><td>Bioshop</td><td>SKI400</td><td>Pour le blocage des membranes WB et CFDB</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>2099-1337410</td><td>Pour l’incubation ECL de CFDB blots d’acide</td></tr><tr><td>p-coumarique&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008</td><td>Pour la fabrication du réactif ECL</td></tr><tr><td>pET24b-SpyCatcher2-Apex2</td><td>Laboratoire Pardee Laboratoire</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour l’expression de la protéine SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td>Conteneur pour l’incubation membranaire WB et CFDB&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate 10 %</td><td>BioShop</td><td>PBS405</td><td>Composant des tampons</td></tr><tr><td>Glutamate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>Un composant de la réaction acellulaire Solution B</td></tr><tr><td>Oxalate de potassium monohydraté (acide oxalique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223425</td><td>Un composant de la réaction acellulaire Solution A</td></tr><tr><td>Gel préfabriqué SDS-PAGE</td><td>BioRad</td><td>4561036EDU</td><td>Pour l’analyse électrophorétique de l’ADN</td></tr><tr><td>polymérase haute fidélité de la protéine Q5</td><td>ONÉ</td><td>M0491</td><td>Pour l’amplification PCR des LET</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Pour la purification des LET</td></tr><tr><td>Ribonucléotide Solution Set</td><td>NEB</td><td>N0450S</td><td>Un composant de la réaction acellulaire Solution A</td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>BioShop</td><td>SKI400</td><td>Utilisé comme agent bloquant pour le Western blot et le CFDB</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>Un composant des tampons de purification des protéines</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q500</td><td>Pour la lyse des cellules bactériennes</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Un composant de la réaction acellulaire Solution Un</td></tr><tr><td>filtre à seringue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGSR33SS</td><td>Pour la stérilisation des tampons et des solutions</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td>Instrument pour l’incubation des réactions PCR</td></tr><tr><td>ARN de transfert (ARNt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8759</td><td>Un composant de la réaction acellulaire Solution Une</td></tr><tr><td>solution saline tamponnée Tris</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60764. K2</td><td>Composant du tampon de lavage WB et CFDB</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Pour la fabrication du tampon tris</td></tr><tr><td>Tunair SS-5012 Demi-déflecteur Shake Flask, 2,5 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-01835-39</td><td>Récipient pour la croissance des cellules E. coli pour l’expression des protéines et la préparation de lysat acellulaire</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>Composant du tampon de lavage WB et CFDB</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Almedic</td><td>7728-A10-100</td><td>Pour la manipulation du</td></tr><tr><td>spectrophotomètre UV-Vis</td> à membrane CFDB NC <td>Thermo Scientific</td><td>13400518</td><td>Utilisé pour la mesure de la concentration en acides nucléiques et de l’ADN et la culture bactérienne OD</td></tr><tr><td>Groupe international de référence de l’OMS pour l’immunoglubuline anti-SARS-CoV-2</td><td>NISBC</td><td>20/268</td><td>Sérums pré-caractérisés pour la vérification et l’optimisation des réactifs/conditions</td></tr> <tr><td>CFDB&bêta ;-Nicotinamide adénine dinucléotide hydraté (NAD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10127965001</td><td>un composant de la réaction acellulaire Solution A</td></tr></tbody></table>

cell-free dot blot en tant que plateforme d’immunodosage pratique et adaptable pour la détection de la réponse anticorps dans les sérums humains et animaux

Cell-Free Dot Blot as a Practical and Adaptable Immunoassay Platform for the Detection of Antibody Response in Human and Animal Sera

Amplification par PCR du modèle d’expression linéaire de l’antigène cible Pour amplifier par PCR le SARS-CoV-2 NP LET, des amorces Ter directes et inverses universelles ont été utilisées comme décrit dans la section 1.2 du protocole et 1 μL du produit a été vérifié sur un gel d’agarose (Figure 4) avant de procéder à la purification du produit PCR.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upl...

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The string of global pathogenic outbreaks over the past two decades has highlighted the importance of serosurveillance strategies. Immunoassay platforms ...

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Grâce à la technologie Luminex Corporation microbille xMAP, nous avons développé le test immunologique multiplexée fluorométrique (MFIA) pour la surveillance de diverses espèces d'animaux de laboratoire. Le MFIA est une micropuce suspension, si l'antigène, le tissu de contrôle ou d'immunoglobulines sont liés de façon covalente à du polystyrène code couleur microsphères. La méthode de test MFIA ainsi que diverses rubriques de dépannage est adressée.

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Le sang périphérique humain est couramment utilisé pour l’évaluation de la réponse immunitaire humorale. Ici, les méthodes permettant d’isoler les lymphocytes B humains du sang périphérique, de différencier les lymphocytes B humains en cellules B sécrétant des anticorps (AB) en culture et d’énumérer les ASC IgM et IgG totales via un test ELISpot sont décrites.

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Nous démontrons une technologie de puce snap pour effectuer des tests immunologiques reactivity-free multiplexée "sandwich" le simplement claquer deux diapositives. Un appareil à pression est utilisé pour le transfert fiable des réactifs de microarray-aux-puces. La puce du composant logiciel enfichable peut être utilisée pour des réactions biochimiques nécessitant une colocalisation des différents réactifs sans contamination croisée.

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