Cell-free dot blot en tant que plateforme d’immunodosage pratique et adaptable pour la détection de la réponse anticorps dans les sérums humains et animaux

Ce protocole fait la démonstration de la technique du sang à points acellulaires, une plateforme d’immunodosage adaptable, accessible et abordable développée en réponse à la pandémie de COVID-19. Les méthodes d’immunodosage de référence existantes comprennent des variantes de la technique ELISA et des tests à flux latéral. Il y a eu un intérêt considérable pour la mise au point de nouveaux essais immunologiques utilisant des technologies telles que les protéines rapportées divisées, les interfaces électrochimiques et les nanoparticules colloïdales.

Le défi est que la plupart des immunoessais de référence sont inaccessibles aux communautés non centralisées en raison de la dépendance à l’égard de composants et d’équipements moléculaires coûteux et sophistiqués. Cette nouvelle technique d’immunodosage CFDB peut être rapidement adaptée aux épidémies émergentes. Il utilise de l’équipement de laboratoire de base et repose entièrement sur des composants moléculaires qui peuvent être produits en interne et dans des environnements à faibles ressources.

Pour commencer, obtenez la séquence protéique de la base de données UniProt en utilisant le code d’accès P0DTC9. Code sur l’optimisation de la séquence pour l’expression basée sur ecoli à l’aide de l’outil d’optimisation du code IDT. Insérez la séquence optimisée dans un modèle SnapGene pour le squelette de construction d’expression avant de commander la séquence optimisée pour la synthèse commerciale sous la forme d’un fragment d’ADN simple brin remis en suspension dans l’eau.

Effectuez un test d’expression initial à l’échelle de cinq microlitres en ajoutant 10 % de produit PCR à la réaction acellulaire ecoli BL21 dans un tube PCR. Incuber la réaction sans secouer à 30 degrés Celsius pendant 15 heures. Évaluer la qualité d’expression de la protéine de la nucléocapside ou de l’antigène NP en chargeant un microlitre de la réaction acellulaire sur un gel à 12 % de SDS et en le transférant sur une membrane de nitrocellulose pour le western blot.

Assemblez une réaction acellulaire à l’échelle d’un millilitre à l’aide d’un produit de matrice d’expression linéaire purifiée de 15 nanomolaires pour le test de transfert de points acellulaires Incuber le mélange d’expression dans un tube conique de 15 millilitres en agitant à 80 tr/min pendant 15 heures à 30 degrés Celsius. Après avoir évalué la qualité de l’expression à l’aide du transfert Western et aliquote 50 microlitres du mélange d’expression, stocker les aliquotes à moins 20 degrés Celsius. Utilisez une image de grille maîtresse comme illustré avec un motif de six centimètres sur six contenant des cercles de 12 x 12, chacun d’un diamètre de deux millimètres, conçu pour correspondre à la capacité de repérage d’une plaque de 96 puits.

Après avoir imprimé la grille maîtresse, prenez fermement en sandwich la grille imprimée entre deux couches de film de plafond de plaque PCR adhésive, coupez le sandwich à la bonne taille le long des bords extérieurs de la grille. À l’aide d’un poinçon de biopsie de deux millimètres, creusez chaque cercle marqué sur la grille. Coupez un morceau de membrane nitrocellulosique de 6,5 x 6,5 centimètres, placez-le sous la grille principale sur une surface propre et fixez-le à l’aide de ruban adhésif.

À l’aide d’un marqueur, marquez les positions des cercles les plus externes sur la membrane de nitrocellulose à utiliser comme guide pour couper la membrane après le repérage de l’échantillon. Diluez les échantillons de sérum de un à 10 dans du PBS. À l’aide d’une micro-pipette, versez des volumes triplés de 0,4 microlitre de chaque échantillon sur la membrane de nitrocellulose à des positions de grille prédéterminées.

Laissez les échantillons tachetés se lier et sécher à température ambiante pendant 10 minutes. À l’aide d’une pince à épiler, récupérez soigneusement la membrane de nitrocellulose et coupez-la le long des cercles extérieurs marqués. Transférez la membrane dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant 10 millilitres de solution bloquante.

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes en secouant doucement à 100 tr/min. Retirez l’aliquote de 50 microlitres du mélange d’expression d’antigène acellulaire du congélateur et, après décongélation, ajoutez-la à cinq millilitres de solution bloquante dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Transférez la membrane directement dans cette solution contenant de l’antigène et incubez à température ambiante pendant une heure, en agitant à 100 tr/min.

Au bout d’une heure, rincez et lavez la membrane au TBST contenant 0,05 % de Tween 20. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de tampon de blocage contenant 10 microgrammes par millilitre de SpyCatcher purifié, deux apex, deux protéines, à la membrane, et placez la membrane dans un plat contenant SpyCatcher apex. Incuber pendant une heure en secouant à 100 tr/min Après avoir rincé la membrane avec une solution saline tris-tamponnée ou du TBS, laver deux fois pendant cinq minutes dans du TBST suivi d’un rinçage final dans du TBS.

Collez et fixez un morceau de parafilm sur une surface de travail propre près de l’instrument d’imagerie par transfert. Retirez l’excès de liquide en tapotant la membrane et à l’aide d’une pince à épiler, placez-le sur le parafilm. Ajoutez immédiatement trois millilitres de solution de chimiluminescence améliorée ou ECL sur la membrane et incubez à température ambiante pendant exactement 90 secondes.

Après avoir séché la membrane, transférez-la dans un instrument d’imagerie compatible avec la chimiluminescence. Utilisez la fonction d’analyse d’image de l’instrument pour obtenir des intensités ponctuelles, y compris pour trois positions à blanc sur la membrane de nitrocellulose. Maintenez un volume de mesure constant par point.

Exportez les données vers une feuille de calcul, en veillant à ce que chaque position de spot soit correctement étiquetée. Calculez la moyenne et l’écart-type des intensités de taches triples. Soustrayez l’arrière-plan de la membrane de nitrocellulose de toutes les mesures d’échantillons.

Ensuite, utilisez l’équation donnée pour obtenir une valeur seuil pour l’interprétation des résultats positifs ou négatifs. Enfin, tracez les données soustraites de la limite dans un graphique à barres. Un test de transfert de points acellulaires a été effectué sur l’humain commercial pré-caractérisé Sarah, et une image du transfert, ainsi que le graphique d’intensité du signal correspondant, est présenté dans cette figure.

Le test par transfert de points acellulaires a permis d’identifier tous les échantillons de contrôle négatifs et les échantillons les plus positifs. Des tests indépendants du test de transfert de points acellulaires au Laboratoire national de microbiologie ont correctement identifié les 12 échantillons négatifs et les 12 échantillons positifs de patients, confirmant ainsi sa robustesse. Le test de transfert de points acellulaires a également détecté des réponses anticorps chez Sarah, un hamster infecté par le SRAS-CoV-2, avec des signaux positifs observés dans 18 des 24 échantillons post-infection prélevés cinq jours après la réinfection, tandis que tous les échantillons pré-infection sont restés négatifs.