Isolement, fixation et caractérisation des leucocytes rénaux juvéniles de dorade royale par cytométrie en flux

Ce protocole normalise l’isolement, la fixation et l’évaluation de la viabilité des leucocytes du rein de tête de la dorade royale par cytométrie en flux, ce qui permet un traitement d’échantillons à haut débit sans compromettre la qualité.

Les techniques traditionnelles telles que le comptage manuel des cellules avec des chambres de Neubauer et les frottis sanguins colorés sont courantes en immunologie des poissons. La cytométrie en flux devient populaire, mais son application dans les études sur les poissons reste limitée. Les méthodes traditionnelles d’immunologie des poissons sont gourmandes en foie et sujettes à des erreurs. Les études sur les animaux juvéniles sont limitées par les difficultés rencontrées pour obtenir des leucocytes purs et la nécessité d’une évaluation immédiate de la viabilité, ce qui limite le débit d’échantillons.

Ce protocole permet une analyse détaillée des cellules immunitaires en identifiant les principales populations de leucocytes et en distinguant les cellules vivantes des cellules mortes. La fixation préserve la viabilité pendant un mois, ce qui permet des flux de travail de cytométrie en flux évolutifs, flexibles et efficaces.

Nos résultats font progresser l’immunologie des poissons en révélant les mécanismes immunitaires et les impacts environnementaux sur la viabilité cellulaire, contribuant ainsi à l’élaboration de stratégies améliorées de gestion des maladies en aquaculture.

[Narrateur] Pour commencer, acclimatez les dorades royales juvéniles, Sparus aurata, dans des systèmes d’aquaculture en recirculation où l’eau est continuellement filtrée et recirculée pour maintenir un environnement stable. S’assurer que le système comprend la filtration mécanique et biologique, l’aération et le contrôle de la température afin de maintenir des paramètres abiotiques optimaux. Ajustez les facteurs environnementaux tels que la photopériode, la température, la salinité, le pH et les niveaux d’oxygène dissous en fonction des besoins spécifiques de l’étude. À l’aide d’un filet, transférez doucement les dorades royales juvéniles dans un récipient de conservation temporaire rempli d’eau du réservoir. Après avoir euthanasié le poisson, placez un poisson sur le côté sur un plateau de dissection stérile. À l’aide d’un scalpel, faites une incision soigneuse le long de la ligne médiane ventrale du poisson, de l’évent vers les branchies. Utilisez des ciseaux de dissection pour étendre l’incision et exposer les organes internes. Localisez le rein de la tête, qui est situé juste derrière les branchies près de la région dorsale antérieure de la cavité corporelle et s’étend le long de la face supérieure sous la colonne vertébrale. À l’aide d’une paire de pinces et de ciseaux à pointe fine, enlevez soigneusement les tissus environnants pour mieux visualiser le rein de la tête. Soulevez ensuite la tête du rein et faites des coupes précises autour de celui-ci pour le libérer des tissus environnants. Placez immédiatement le rein excisé dans une passoire cellulaire placée dans une boîte de Pétri stérile. Pipetez deux millilitres de solution saline équilibrée de Hanks, ou HBSS, dans une boîte de Pétri stérile. Faites macérer le rein excisé sur la passoire cellulaire à l’aide du piston d’une seringue pour libérer les cellules dans la solution. Ensuite, préparez une solution de milieu à gradient de densité. Pipeter 600 microlitres de la solution de milieu à gradient de densité dans des tubes de polystyrène à fond rond de cinq millilitres. Transférez lentement deux millilitres de suspension cellulaire de la boîte de Pétri dans chaque tube. Centrifuger à 400 g pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius avec le frein desserré. Après la centrifugation, retirez le tube et observez l’anneau leucocytaire. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, transférez doucement environ 100 microlitres de l’anneau leucocytaire dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. Maintenant, augmentez le volume à deux millilitres avec HBSS et remettez doucement les cellules en suspension. Centrifugez l’échantillon à 400 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille au fond du tube. Ensuite, remettez en suspension la pastille purifiée dans un millilitre de HBSS jusqu’à ce que la concentration finale des cellules soit comprise entre 10 000 et un million de cellules par millilitre. Ajoutez 50 microlitres de diméthylsulfoxyde dans un flacon contenant le colorant réactif. Après avoir ajusté la densité cellulaire à un million de cellules par millilitre, transférez un millilitre de suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de deux millilitres. Préparer les échantillons de contrôle de viabilité tels qu’ils ont été donnés. Induisez la mort cellulaire dans les tubes trois et quatre en les plaçant dans un bain-marie à 70 degrés Celsius pendant sept minutes. Pour colorer les cellules, pipetez un microlitre de colorant fluorescent reconstitué dans les tubes deux et quatre contenant un millilitre de suspension cellulaire et mélangez bien. Incuber les tubes colorés à température ambiante pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un millilitre de HBSS et remettez en suspension la pastille finale dans 900 microlitres du même tampon. Ensuite, pipetez 100 microlitres de formaldéhyde à 37 % pour fixer les cellules, et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Après avoir lavé les cellules deux fois avec un millilitre de HBSS contenant 1 % de BSA, remettre en suspension dans un millilitre de la même solution. Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius dans un réfrigérateur jusqu’à un mois. Placez le tube d’échantillon fixe dans l’orifice d’échantillonnage du cytomètre en flux pour l’analyse. Enregistrez un minimum de 10 000 événements pour chaque échantillon à l’intérieur de la porte des singles. Enregistrez toutes les données et sauvegardez-les sur des disques externes ou un stockage en nuage. Visualisez les données de cytométrie en flux en traçant la zone de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion latérale pour évaluer la taille et la granularité des cellules. Effectuez une porte de cellule singulet et excluez les multiplets en traçant la zone de diffusion vers l’avant par rapport à la hauteur de diffusion vers l’avant. Identifiez les trois populations de leucocytes en fonction des profils de diffusion vers l’avant et sur les côtés. Définissez le seuil de viabilité de la coloration du colorant dans le canal de fluorescence correspondant pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Dans des conditions optimales, les lymphocytes, les monocytes et les granulocytes constituaient respectivement 31 %, 38 % et 31 % de la population leucocytaire, tandis qu’en cas de stress thermique, les lymphocytes diminuaient à 21,3 %, les monocytes augmentaient à 45,6 % et les granulocytes restaient stables à 33,1 %. L’échantillon exposé à des conditions optimales a montré une viabilité plus élevée, avec une prédominance de cellules vivantes dans toutes les populations de leucocytes. En revanche, l’échantillon soumis à un stress thermique a montré une augmentation significative de la mort cellulaire.