Name: Une méthode simple à double tube de centrifugation pour obtenir du plasma riche en plaquettes à partir de sang équin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Apprenez une méthode simple à double centrifugation pour préparer du plasma riche en plaquettes à partir de sang équin. Cette technique économique permet de traiter les troubles musculosquelettiques des chevaux en clinique vétérinaire.

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Cette étude a été menée conformément aux protocoles internes pour la préparation et l’utilisation du PRP chez les chevaux à l’hôpital d’enseignement vétérinaire de l’Universidad de Caldas, Manizales, Colombie. Cette étude n’a pas nécessité l’approbation du Comité interne de protection des animaux, car les données ont été obtenues à partir de chevaux boiteux traités cliniquement dans notre établissement. Les données de six chevaux créoles colombiens, trois juments et trois hongres, d’un âge moyen de 7,4 (± 2,6) ans ont été utilisées pour développer ce protocole. Les propriétaires des chevaux ont été informés de la nature de l’étude et ont signé un formulaire de consentement éclairé. Tous les chevaux inclus dans l’étude étaient cliniquement sains, à l’exception du problème musculo-squelettique traité. Seuls les animaux dont la numération plaquettaire basale est supérieure à 100 × 103/mL de sang total ont été inclus. Il est important de noter que les chevaux ayant des concentrations plaquettaires plus faibles peuvent être considérés comme thrombocytopéniques14. De plus, ces animaux présentaient des numérations globulaires, des paramètres biochimiques cliniques hépatiques et rénaux normaux et des valeurs d’analyse d’urine dans la plage normale pour l’espèce équine.
1. Restriction du cheval et désinfection de la peau
<ol>
	<li>Pour la sécurité du cheval et du vétérinaire, immobiliser le cheval (Eqqus caballus) en toute sécurité dans une goulotte d’examen clinique ou avec une bride (Figure 1A), en fonction du comportement de l’animal. Ensuite, coupez une zone de cheveux de 5 cm x 5 cm avec un rasoir électrique au milieu d’un côté du cou, sur la veine jugulaire. REMARQUE : Certains propriétaires préfèrent que le cheval ne soit pas tondu. Une étude indique qu’il n’est pas nécessaire de couper les cheveux au site de ponction veineuse pour prévenir la contamination bactérienne du P-PRP21. Par conséquent, cette procédure est à la discrétion du vétérinaire.</li>
	<li>Effectuer une préparation cutanée préliminaire non stérile sur la zone coupée de la veine jugulaire sur au moins 10 cm à l’aide d’une gaze non stérile et de gants pendant environ 3 min. Appliquez plusieurs morceaux de gaze imbibés de mousse antiseptique en formant un motif circulaire (figure 1B).</li>
	<li>Préparez le site de ponction veineuse de manière aseptique à l’aide de gants stériles et de gaze imbibée de désinfectant. Frottez la peau de la région du cou en mouvements circulaires pendant environ 5 min. Nettoyez la zone avec de la gaze stérile imbibée d’alcool éthylique à 95 %.</li>
</ol>
2. Prélèvement sanguin aseptique
<ol>
	<li>Placez 16 tubes de citrate de sodium de 4,5 ml, préalablement nettoyés avec de la gaze imbibée d’alcool éthylique à 95 %, dans une grille en plastique propre. Imprégnez les capuchons en caoutchouc des tubes à vide avec de l’alcool éthylique à 95 %, en particulier dans l’évidement pour l’accouplement de l’aiguille. REMARQUE : En général, huit tubes de citrate de sodium de 4,5 ml sont nécessaires pour obtenir 2,5 ml de PRP. Le nombre de tubes utilisés dans un cas particulier dépendra des tissus mous ou de l’articulation spécifique traitée.</li>
	<li>Insérez stérilement une aiguille papillon dans le site jugulaire désinfecté (figure 2A) et fixez des tubes de citrate de sodium de 4,5 ml au support (figure 2B). Secouez doucement les tubes et placez-les dans une grille en plastique. REMARQUE : Un tube de citrate de sodium de 4,5 ml est utilisé pour les hémogrammes automatisés et pour préparer le plasma après une centrifugation par centrifugation par centrifugation par centrifugation dure. Ce plasma est ensuite utilisé comme témoin négatif pour les comparaisons de facteurs de croissance et d’enrichissement en cytokines avec le PRP.</li>
</ol>
3. Approvisionnement en plasma riche en plaquettes
<ol>
	<li>Placez les tubes de citrate de sodium de 4,5 ml contenant du sang total dans un rotor pivotant à quatre places à un angle de 90° dans une centrifugeuse de paillasse. Centrifuger les tubes à 120 × g pendant 5 min à température ambiante. Après la centrifugation, placez les tubes de 4,5 mL contenant du sang citraté et deux tubes simples supplémentaires de 10 mL dans un support et placez le support du côté non dominant de la main de l’opérateur à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire de classe II sur un champ stérile et imperméable. REMARQUE : Une étude suggère qu’une hotte à flux laminaire de classe II n’est pas essentielle pour prévenir la contamination bactérienne lors de l’approvisionnement en PRP21. Au lieu de cela, le PRP peut être préparé dans une salle blanche exempte de courants d’air et de poussière. Dans ce scénario, le support de tube sanguin peut être placé sur une table recouverte d’un rideau stérile et imperméable.</li>
	<li>Première centrifugation : À l’aide d’un masque facial et de gants stériles, placez une seringue Luer stérile de 10 mL couplée à une aiguille stérile (21 G 5/8") sur le côté dominant de la main à l’intérieur de la hotte à flux laminaire. REMARQUE : À partir de ce moment, la main gantée dominante reste toujours stérile, tandis que les capuchons en caoutchouc des tubes de citrate de sodium doivent être retirés à l’aide de la main gantée non dominante.</li>
	<li>Insérez l’aiguille stérile dans chaque tube de sang citraté centrifugé sur 3 mm sur la couche leucocytaire (Figure 3A) et aspirez doucement 50 % de la fraction plasmatique, en évitant les turbulences du fluide et l’aspiration du sang. Une fois que 10 mL de plasma de quatre tubes de 4,5 mL ont été aspirés, répartissez-les dans des tubes simples stériles de 5 à 10 mL (figure 3B). REMARQUE : Retirez les capuchons en caoutchouc de ces tubes avec la main non dominante et placez-les sur un site stérile du champ ou tenez-les pour éviter la contamination bactérienne.</li>
	<li>Deuxième centrifugation : refermer les tubes à l’aide des bouchons en caoutchouc et les placer à l’état équilibré dans un rotor pivotant à quatre places à un angle de 90° dans la centrifugeuse de paillasse et faire tourner ces tubes à 240 × g pendant 5 min à température ambiante. REMARQUE : Le choix de la force de centrifugation relative (RCF ou g) est basé sur une étude séminale14 qui a décrit pour la première fois cette méthode d’obtention du PRP à partir de sang équin. De plus, la reproductibilité de cette méthode a été évaluée par d’autres auteurs22.</li>
	<li>Placez les tubes dans une grille et positionnez-les du côté non dominant à l’intérieur de la hotte à flux laminaire de classe II, au-dessus du drapé stérile et imperméable préalablement posé.</li>
	<li>À l’aide de la main non dominante, retirez les capuchons en caoutchouc et de la main dominante stérile, aspirez lentement les premiers 75 % de plasma à l’aide d’une aiguille spinale de 18 g de 90 mm fixée à une seringue Luer stérile de 10 ml (figure 3C). Jetez cette seringue ou réservez-la pour d’autres utilisations expérimentales ou cliniques car elle contient du plasma pauvre en plaquettes (PPP). Ensuite, fixez l’aiguille spinale stérile précédemment utilisée à une seringue Luer stérile de 5 ou 10 ml pour aspirer le plasma restant (25 %) du tube ordinaire stérile de 5 à 10 ml. Cette fraction est connue sous le nom de P-PRP (Figure 3D). REMARQUE : Dans certaines conditions cliniques et expérimentales, une aliquote de 0,5 à 1 mL de PRP est utilisée pour les hémogrammes automatisés suivis d’une analyse du facteur de croissance (TGF-β1 et PDGF-BB) par dosage immuno-enzymatique. La mesure de ces médiateurs peut être effectuée 3 h après l’activation du P-PRP avec des sels de calcium ou de la thrombine23 ou après l’induction de lésions cellulaires par changement de température ou l’ajout de détergents non ioniques24.</li>
	<li>Enveloppez la seringue Luer stérile contenant du PRP dans un petit champ stérile imperméable avec une aiguille ou un capuchon stérile attaché pour prévenir la contamination bactérienne du produit orthobiologique (figure 4A). REMARQUE : La structure anatomique du cheval à traiter doit être préparée pour l’injection aseptique comme décrit dans la section 1 de ce protocole. Le cheval doit être correctement attaché et mis sous sédatif pour minimiser l’inconfort et assurer la sécurité du cheval et du vétérinaire. Le produit PRP doit être manipulé à l’aide de gants et d’aiguilles stériles et peut être activé ou non selon la préférence du praticien (figure 4B).</li>
</ol>
4. Analyse statistique
<ol>
	<li>Recueillir des données sur les numérations plaquettaires et leucocytaires dans le sang total et le PRP. Évaluez la normalité des données à l’aide du test de Kolmogorov-Smirnov. Si les données sont distribuées normalement (P &gt; 0,05), comparez et analysez les données de la cellule à l’aide du test t. Si les données sur les concentrations de plaquettes et de leucocytes ne sont pas normalement distribuées (P &lt; 0,05), comparez et analysez les données à l’aide d’un test de Wilcoxon.</li>
	<li>Déterminer l’efficacité plaquettaire et leucocytaire dans le P-PRP selon les formules suivantes25 : Efficacité de la collecte des plaquettes = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67985/67985eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100 Efficacité de collecte des leucocytes = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67985/67985eq02.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>Recueillir des données sur les concentrations de TGF-β1 et de PDGF-BB dans les surnageants plasmatiques (contrôle négatif) du PRP (après 3 h d’activation avec le gluconate de calcium) et les lysats de PRP obtenus par l’ajout d’une solution détergente non ionique.</li>
	<li>Utilisez un modèle mixte linéaire généralisé pour comparer les concentrations de facteurs de croissance entre le plasma, les surnageants PRP et le lysat PRP. En cas de différences statistiques significatives, appliquez un test post-hoc de Tukey.</li>
	<li>Considérons que p &lt; valeurs de 0,05 sont statistiquement significatives pour tous les tests.</li>
</ol>

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<li>Carmona, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effects+of+platelet-rich+gel+supernatants+on+histology+and+chondrocyte+apoptosis+scores%2C+hyaluronan+release+and+gene+expression+of+equine+cartilage+explants+challenged+with+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro effects of platelet-rich gel supernatants on histology and chondrocyte apoptosis scores, hyaluronan release and gene expression of equine cartilage explants challenged with lipopolysaccharide.</a> BMC Vet Res. 12 (1), 135(2016).</li>
<li>Castillo-Franz, C., López, C., Carmona, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+catabolic+and+anabolic+gene+expression+effects+and+histology+changes+induced+by+platelet-rich+gel+supernatants+in+equine+suspensory+ligament+explants+challenged+with+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22MLTJ-Muscles+Ligaments+and+Tendons%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the catabolic and anabolic gene expression effects and histology changes induced by platelet-rich gel supernatants in equine suspensory ligament explants challenged with lipopolysaccharide.</a> MLTJ-Muscles Ligaments and Tendons. 11 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Argüelles, D., Carmona, J. U., Climent, F., Muñoz, E., Prades, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet+concentrates+as+a+treatment+for+musculoskeletal+lesions+in+five+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Rec%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet concentrates as a treatment for musculoskeletal lesions in five horses.</a> Vet Rec. 162 (7), 208-211 (2008).</li>
<li>Carmona, J. U., Argüelles, D., Climent, F., Prades, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+platelet+concentrates+as+a+treatment+of+horses+with+osteoarthritis%3A+a+preliminary+pilot+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Equine+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Autologous platelet concentrates as a treatment of horses with osteoarthritis: a preliminary pilot clinical study.</a> J Equine Vet Sci. 27 (4), 167-170 (2007).</li>
<li>Dejnek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Content+of+blood+cell+components%2C+inflammatory+cytokines+and+growth+factors+in+autologous+platelet-rich+plasma+obtained+by+various+methods%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Orthop%22%5BJournal%5D)">Content of blood cell components, inflammatory cytokines and growth factors in autologous platelet-rich plasma obtained by various methods.</a> World J Orthop. 13 (6), 587-602 (2022).</li>
<li>Giraldo, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+breed%2C+sex+and+age+on+cellular+content+and+growth+factor+release+from+equine+pure-platelet+rich+plasma+and+pure-platelet+rich+gel%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of the breed, sex and age on cellular content and growth factor release from equine pure-platelet rich plasma and pure-platelet rich gel.</a> BMC Vet Res. 9, 29(2013).</li>
<li>Zimmermann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+technique+and+white+cell+content+influence+the+detectable+levels+of+growth+factors+in+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Sample preparation technique and white cell content influence the detectable levels of growth factors in platelet concentrates.</a> Vox Sang. 85 (4), 283-289 (2003).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubes de prélèvement de sang veineux simples de 10 ml.</td><td>BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, États-Unis</td><td>Réf 366430</td><td>Ce n’est qu’un exemple, des tubes d’autres marques peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>Tubes de citrate de sodium de 4,5 mL (105 M/3,2 %)&nbsp ;</td><td>BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, États-Unis</td><td>107451</td><td>Ce n’est qu’un exemple, des tubes d’autres marques peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de banc</td><td>Rotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, Allemagne</td><td></td><td>D’autres centrifugeuses de banc peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>Aiguille papillon (21 G &times ; 0,75 po) avec 12 po. tube et support pré-attaché</td><td>Kit de prélèvement de sang Safety-Lok, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, États-Unis</td><td>Réf 367296</td><td>Ce n’est qu’un exemple, des aiguilles papillon d’autres marques peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>Solution de mousse de chlorhexidine à 2,3-4 %&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>La marque ou le nom commercial de ces produits peuvent varier d’un pays à l’autre.</td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire de classe II</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, États-Unis</td><td></td><td>D’autres hottes à flux laminaire de classe II peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Lecteur ELISA</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique à 95 %</td><td></td><td></td><td>La marque ou le nom commercial de ces produits peuvent varier d’un pays à l’autre.</td></tr><tr><td>Humain PDGF-BB DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, États-Unis</td><td>DY220</td><td></td></tr><tr><td>TGF-bêta humain 1 DouSet ELISA</td><td>R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, États-Unis</td><td>DY240</td><td></td></tr><tr><td>Solution de mousse de povidone iodée à 4-10 %&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>La marque ou le nom commercial de ces produits peuvent varier d’un pays à l’autre.</td></tr><tr><td>Logiciel SPSS 25.0</td><td>IBM Corp, SPSS, NY, ÉTATS-UNIS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringues Luer stériles de différents volumes&nbsp ;</td><td>Discardit Seringue, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, États-Unis</td><td></td><td>Ce n’est qu’un exemple, des seringues d’autres marques peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>Aiguille spinale stérile (18 G & fois 90 mm)&nbsp ;</td><td>Aiguille de spinelle BD Quincke, Franklin Lakes, NJ, États-Unis</td><td></td><td>Ce n’est qu’un exemple, des aiguilles vertébrales d’autres marques peuvent être utilisées.</td></tr></tbody></table>

une méthode simple à double tube de centrifugation pour obtenir du plasma riche en plaquettes à partir de sang équin

A Simple Double Centrifugation Tube Method to Obtain Platelet-rich Plasma from Equine Blood

La numération plaquettaire moyenne (plaquettes × 103/μL) était significativement plus élevée dans le PRP que dans le sang total (p &lt; 0,001). En revanche, la concentration moyenne de leucocytes (leucocytes × 103/μL) dans le PRP était significativement plus faible que dans le sang total (p &lt; 0,001) (tableau 1). Plus précisément, la numération plaquettaire dans le PRP était 2,41 fois plus élevée que dans le sang total, tandis que la concentration de leucocytes dans le PRP était 0...

Une méthode simple à double tube de centrifugation pour obtenir du plasma riche en plaquettes à partir de sang équin

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Préparation du Pooled lysat plaquettaire humain (pHPL) comme un supplément efficace pour animaux sans sérum humain cultures de cellules souches

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Turbidimétrie sur Human Washed: L&#39;effet Plaquettes du Pannexin1 inhibiteur bleu brillant FCF sur l&#39;agrégation induite par le collagène

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Une méthode simple à double tube de centrifugation pour obtenir du plasma riche en plaquettes à partir de sang équin

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