Protocole de cytométrie par électroporation pour la microscopie à fluorescence de cellules vivantes à l’aide de la culture de cellules U2 OS

La portée de cette recherche se concentre sur l’effet des champs électriques pulsés sur le comportement des cellules, en particulier sur la façon dont l’électroporation affecte le cycle cellulaire.

Le principal avantage de ce protocole est la possibilité d’effectuer des expériences d’électroporation de cellules vivantes en continu à l’aide de cultures de cellules de mammifères pendant une période allant jusqu’à 72 heures. Notre laboratoire se concentre sur l’adaptation de ces techniques à la microfluidique, ce qui permettra de réduire la taille des échantillons, les besoins en réactifs et un meilleur contrôle des échantillons pour les futurs protocoles.

[Narrateur] Pour commencer, cultivez des cellules U2OS FUCCI CA5 dans une plaque de 10 centimètres avec 10 millilitres de DMEM à haute teneur en glucose contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un environnement à 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque la culture atteint 80 % de confluence, aspirez le milieu de la plaque. Lavez les cellules avec du PBS puis ajoutez un millilitre de trypsine à 0,25 % et incubez pendant 1,5 minute pour dissocier les cellules. Neutraliser la trypsine en remettant en suspension les cellules dissociées dans cinq millilitres de DMEM à haute teneur en glucose. Obtenez un échantillon de 100 microlitres de la culture remise en suspension et placez-le sur la lame inférieure du couvercle en verre à l’intérieur de la chambre du système de cytométrie par électroporation. Assurez-vous que la chambre est confluente à 30 % après l’introduction de l’échantillon. Ajoutez lentement quatre millilitres de DMEM à haute teneur en glucose à l’extrémité de la chambre, empêchant le liquide de rincer l’échantillon. Placez une lame de microscope standard sur la chambre et incubez la chambre à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Allumez le microscope à fluorescence inversée avec une chambre de contrôle de l’environnement pour permettre au système de se stabiliser avant l’électroporation. Pendant que la chambre environnementale se stabilise, utilisez des câbles à pince crocodile pour connecter un multimètre numérique au condensateur du générateur d’impulsions et à l’interrupteur haute tension pour une configuration rapide avec la chambre d’électroporation. Maintenant, sélectionnez le grossissement 20x sur le microscope. Dans le logiciel du microscope, assurez-vous que les canaux FITC/GFP et A594 Texas Red M Cherry sont sélectionnés, correspondant aux deux protéines fluorescentes du système FUCCI CA5. Utilisez des paramètres d’exposition faibles, généralement inférieurs à 0,05 seconde, pour éviter d’endommager les photos lors de l’imagerie à long terme. Prenez des images de test pour optimiser la mise au point et la qualité de l’image avant de lancer l’imagerie en accéléré. Programmez le time lapse pour capturer des images de trois à six points de vue différents toutes les 10 minutes sur une période de 24 heures afin d’obtenir un volume élevé de données de cycle cellulaire par laps de temps tout en atténuant les dommages photo. Assurez-vous que la mise au point automatique est activée pour le canal A594 afin d’optimiser le suivi de la culture pendant le laps de temps. Laissez le logiciel ouvert jusqu’à ce que l’électroporation soit terminée. Placez la chambre de cytométrie par électroporation dans le microscope équipé d’une chambre environnementale appropriée. Avant l’électroporation, gardez la chambre fermée et assurez-vous que le système environnemental reste en marche pour maintenir des conditions de cycle cellulaire appropriées. Ouvrez la chambre climatique et fixez un multimètre numérique au générateur d’impulsions, puis à l’aide de câbles à pince crocodile, connectez le générateur d’impulsions aux électrodes de la chambre. Chargez le condensateur du générateur d’impulsions à 180 volts. Déchargez rapidement l’impulsion dans la chambre jusqu’à ce que le multimètre numérique affiche zéro volts. Retirez toutes les connexions électriques de la chambre et replacez rapidement le couvercle de la chambre pour assurer des conditions d’élevage optimales. Activez l’imagerie en accéléré immédiatement une fois que la chambre environnementale est bien en place. Une fois le laps de temps terminé, utilisez le logiciel du microscope pour enregistrer toutes les images capturées en une seule vidéo. Ajustez la qualité visuelle pour améliorer la clarté des caractéristiques des cellules pour la quantification manuelle. Enfin, observez les changements dans les signaux FITC et A594 au fil du temps pour suivre les phases des cellules dans la vidéo en accéléré. À l’aide du système Fuji, des données visuelles ont été collectées en suivant les changements de couleur liés à l’expression et à l’ubiquitination des protéines, ce qui a permis de distinguer clairement les phases G1, S, G2, M. Cela a permis d’observer directement la progression du cycle cellulaire dans des conditions variables. Cette figure résume les principales données recueillies à partir de deux séries d’expériences utilisant des cultures cellulaires non synchronisées et synchronisées en phase S. L’exposition au champ électrique pulsé dans des cellules non synchronisées a considérablement augmenté la longueur moyenne des phases G1, G2 et M, tandis que la phase S est restée inchangée. Dans les cellules synchronisées, l’exposition au champ électrique pulsé a entraîné une réduction de la durée des phases G1, S et G2, bien que seules S et G2 aient été statistiquement significatives, tandis que la phase M n’a pas été affectée.