Name: Préparation et maintenance d’une expérience de cage bio-exclusion isopositive pour la transplantation fécale humaine chez des souris exemptes de germes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Découvrez la transplantation fécale chez des souris exemptes de germes à l'aide de cages ISO positives. Cette méthode permet d'étudier le rôle du microbiome dans le cancer et de valider des relations causales en recherche oncologique.

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Les souris exemptes de germes sont un outil essentiel dans le répertoire des chercheurs sur le microbiome, car elles permettent de disséquer la contribution du microbiote dans la santé de l’hôte et les états pathologiques. Les souris exemptes de germes naissent complètement stériles et restent axéniques toute leur vie1. La colonisation de souris exemptes de germes par des souches bactériennes spécifiques permet d’étudier les causes à effet entre ces taxons et les fonctions métaboliques, immunitaires ou autres fonctions de l’hôte 2,3,4,5. La capacité d'« humaniser » les souris exemptes de germes au niveau du microbiote en transplantant des matières fécales obtenues de donneurs humains et, lorsqu’elles sont hébergées dans des conditions barrières, d’empêcher la contamination par des micro-organismes dérivés de murins est particulièrement avantageuse1. Cette approche a permis de nombreuses découvertes importantes dans le domaine du microbiome, par exemple, l’effet du microbiome intestinal humain sur la réponse à l’immunothérapie du cancer 6,7,8.
Cependant, bien que les souris humanisées sans germes soient inestimables pour les efforts de recherche dans le domaine du microbiome, de nombreuses limites ont inhibé l’adaptation plus large de cette approche. Les souris exemptes de germes sont élevées et maintenues dans de grands isolateurs semi-rigides ou à film flexible, mais les expériences fonctionnelles nécessitent la mise en place de mini-isolateurs séparés, avec un mini-isolateur abritant plusieurs cages mais seulement dans une seule condition expérimentale. Cette approche de mini-isolant augmente l’empreinte spatiale et le coût tout en limitant considérablement le nombre de conditions expérimentales pouvant être étudiées dans une expérience et le nombre d’expériences pouvant être menées en parallèle. Une solution prometteuse consiste à utiliser un système de cage individuel et modulaire appelé système de bioexclusion ISOcage P (ici appelé système d’isocage)9,10. Le système d’isocage permet de manipuler expérimentalement des souris exemptes de germes dans des cages d’isolement à pression positive individuelles hermétiquement fermées, ce qui permet des conditions expérimentales distinctes entre chaque cage plutôt qu’entre chaque mini-isolateur. Avec la technique d’asepsie appropriée, les animaux peuvent être logés dans des isocages jusqu’à 12 semaines dans des conditions exemptes de germes ou humanisés par transplantation fécale humaine pour être utilisés dans toute approche expérimentale compatible (c’est-à-dire qu’ils peuvent être réalisés dans des conditions aseptiques). Plusieurs expériences indépendantes peuvent être menées en parallèle à l’aide du système d’isocage, et l’encombrement et le coût sont considérablement inférieurs à ceux de plusieurs expériences sur des mini-isolateurs.
Le but de l’élevage de souris sans germes dans des isolateurs de reproduction à film flexible est de préserver soigneusement le statut axénique11. Les techniques utilisées pour surveiller l’état d’absence de germes comprennent des écouvillonnages réguliers des surfaces corporelles et des cavités buccales de souris, ainsi que la collecte aseptique d’échantillons fécaux, qui sont à la fois cultivés et analysés par des tests commerciaux basés sur la PCR. Des tests bactériens, sérologiques et fongiques de ces échantillons sont tous nécessaires pour déterminer l’état d’absence de germes11. Lorsque des souris exemptes de germes sont transférées d’isolateurs de reproduction à des isocages à des fins expérimentales, les souris sont prélevées et testées pour valider leur statut d’absence de germes lors du transfert. Les contrôles de stérilité en isocage sont effectués par le biais d’une collecte aseptique d’échantillons fécaux, qui sont ensuite mis en culture pour détecter les contaminants bactériens, viraux et fongiques. Il est nécessaire de collecter et d’enregistrer soigneusement les résultats de ces contrôles de stérilité de la naissance à la fin d’un protocole expérimental pour valider le statut d’absence de germes de ces souris.
Le système d’isocage est composé de cages individuelles (figure 1), de disques de transfert pour le transport hors des isolateurs d’élevage (figure 1) et du support isocage, qui abrite les cages (figure 2). Chaque isocage contient un filtre HEPA (High Efficiency Particulate Air) au niveau de la cage installé sur l’entrée d’air soufflé et un joint d’étanchéité en silicone qui assure un joint étanche à l’air lorsqu’il est fermé, garantissant qu’aucun contaminant ne peut pénétrer dans la cage par l’air (Figure 1A). Ce couvercle de cage peut être utilisé comme surface de travail stérile lorsqu’il est placé à l’envers dans une enceinte de biosécurité stérilisée (figure 1A). Une grille à l’intérieur de la cage contient la bouteille de nourriture et d’eau (figure 1B). Les pinces autoclavées à l’intérieur de la cage sont utilisées pour toutes les manipulations qui nécessitent un contact avec les surfaces intérieures de la cage. La cage elle-même est munie d’encoches pour un porte-carte de cage amovible permettant d’identifier les animaux à l’extérieur et de buses d’admission et d’exportation d’air qui s’amarrent dans le support isocage (figure 1C-E). Des pinces de fermeture sûres et un verrou à languette sur le couvercle scellent la cage lorsqu’elle est prête à être réamarrée sur le système de rack (Figure 1F). La litière suggérée est de l’Alpha-dri, et une hutte d’enrichissement autoclavable est également recommandée (figure 1F). Les disques de transfert sont utilisés pour déplacer les souris exemptes de germes des isolateurs reproducteurs aux isocages et contiennent un couvercle à compartiment rotatif avec une ouverture triangulaire pour permettre la manipulation des animaux (figure 1G-H). Les disques sont de petite taille (21,6 cm de diamètre) et de grande taille (28 cm de diamètre), qui ont toutes deux une capacité de huit souris. Le ruban autoclave est utilisé pour créer des joints étanches à l’air sur la circonférence et les trous d’aération du disque, ce qui est effectué avant le trempage avec un stérilisant et le transport dans un sac imbibé de stérilisant (figure 1I). Le système de rack lui-même dispose d’un écran pour surveiller les ventilateurs, de l’état du filtre HEPA au niveau du rack et de l’alimentation de la batterie de secours du rack, qui sont toutes des fonctionnalités incluses dans le système (Figure 2A). Une jauge Magnehelic fermée indique la pression positive maintenue par le système de cage, et un indicateur visuel d’amarrage automatique indique l’état d’amarrage des cages (languette jaune sortie signifie qu’aucune cage n’est amarrée ou que le quai n’a pas réussi) (Figure 2B-D). Une enceinte de biosécurité certifiée standard est également nécessaire pour la manipulation des isocages.
Le protocole présenté ici décrit les méthodes appropriées pour réussir le transfert de souris exemptes de germes des isolateurs de reproduction dans des conditions aseptiques aux isocages tout en maintenant le statut exempt de germes, l’humanisation des souris exemptes de germes avec de la boue fécale de donneur humain et la collecte de matières fécales de souris hébergées dans l’isocage pour la confirmation du statut exempt de germes ou la préservation de la viabilité pour des études fonctionnelles ultérieures. Dans cet exemple, des souris exemptes de germes sont humanisées avec des échantillons fécaux groupés de sujets humains traités par immunothérapie pour le cancer du poumon et dichotomisées en tant que répondeurs ou non-répondeurs au traitement. Dans ce cas, le phénotype de la réponse à la réponse d’immunothérapie a été transféré par l’humanisation du microbiote intestinal aux souris receveuses, qui ont ensuite pu être inoculées avec des cellules tumorales et traitées par immunothérapie. Le protocole de suspension fécale humaine peut être facilement adapté à n’importe quel modèle préclinique de donneur humain ou à tout modèle préclinique de maladie souhaité par l’investigateur. À l’aide de ce protocole, il est possible de transférer n’importe quel microbiote fécal humain dans l’hôte exempt de germes, ce qui permet d’approfondir les recherches sur le rôle du microbiote dans la santé et la maladie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68029/68029fig01.jpg"> 
Figure 1 : Schéma de principe de l’isocage et des disques de transfert. (A) Vue de haut en bas de la face inférieure du couvercle de la cage, avec des étiquettes indiquant l’emplacement du filtre HEPA interne au niveau de la cage et du joint d’étanchéité en silicone. (B) Vue de haut en bas de l’intérieur de la cage, avec des étiquettes indiquant le couvercle de la barre métallique, la bouteille d’eau interne et le bec, ainsi que l’emplacement dans la grille pour contenir la nourriture autoclavable. (C) Vue de face de la cage montrant les encoches du porte-carte de la cage. (D) Vue de haut en bas d’une cage pleine avec le couvercle sur le dessus, montrant comment le filtre HEPA est installé sur la buse d’admission d’air. (E). Vue arrière de la cage montrant les buses d’admission et d’exportation d’air qui s’amarrent au système de rack isocage. (F) Vue latérale d’une cage pleine avec le couvercle sur le dessus, avec des étiquettes indiquant les pinces de fermeture sûres en position ouverte, avec des languettes blanches sur chaque pince qui les verrouillent en place. L’intérieur de la cage montre une litière d’Alpha-dri superposée au fond et une cabane d’enrichissement suggérée placée dans la litière. (G) Vue de haut en bas des disques de transfert avec le couvercle sur le dessus. (H) Vue de haut en bas de l’intérieur du disque de transfert, montrant le couvercle du compartiment rotatif avec une ouverture triangulaire pour permettre la manipulation des animaux. (I) Vue latérale du disque de transfert entièrement assemblé montrant l’emplacement du ruban autoclave, qui crée un joint étanche à l’air pendant le transfert de l’isolateur d’élevage à l’isocage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68029/68029fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68029/68029fig02.jpg"> 
Figure 2 : Schéma de principe du système de rack isocage. (A) Support isocage complet avec cages amarrées et une étiquette indiquant l’écran de surveillance de l’état du ventilateur d’air, du filtre HEPA et de la batterie de secours. Sur le côté inférieur gauche du rack se trouve l’emplacement pour le filtre HEPA au niveau du rack. (B) Manomètre magnéhélique fermé indiquant la pression positive maintenue par le rack. (C) Une isocage amarrée sans indicateur d’amarrage jaune visible, démontrant une connexion réussie entre le rack et les buses d’air. (D) Une fente vide dans le rack, avec un indicateur visuel visuel visible d’amarrage automatique indiquant qu’aucun rack n’est en place et qu’il n’y a pas de connexion des buses d’air avec une isocage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68029/68029fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>1 mL de seringue à embout coulissant BD stérile, à usage unique</td><td>Fisher Scientific</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Tube à bouchon à vis de 2,0 ml, sans molette, jupe, naturel, tube stérile à faisceau d’E avec capuchon attaché</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-755-228</td><td></td></tr><tr><td>36 x 32 x 48" 3 Mil Sacs en polyéthylène à soufflet</td><td>Uline</td><td>S-13455</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de 5 gallons d’activateur de stérilisant au dioxyde de chlore Exspor&nbsp ;</td><td>Ecolab</td><td>6301680</td><td></td></tr><tr><td>réservoir de 5 gallons de base stérilisante au dioxyde de chlore Exspor</td><td>Ecolab</td><td>6301194</td><td></td></tr><tr><td>béchers en polypropylène de 600 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>S01914</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-dri literie</td><td>Shepherd Specialty Papers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre anaérobie</td><td>Coy Lab Products</td><td>Type B</td><td></td></tr><tr><td>Enceinte de biosécurité classe 2</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Certifié IsoCage filtre HEPA autoclavable XT Extreme Temperature</td><td>Tecniplast</td><td>1245ISOFHXT</td><td></td></tr><tr><td>Verres Transparents LPX IQuity Lunettes de Sécurité&nbsp ;</td><td>Fastenal</td><td>922205455</td><td></td></tr><tr><td>DuPont&nbsp ; Tyvek&nbsp ; Manchon - 18"</td><td>Uline</td><td>S-13893E</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences DURAN 45 mm Push-on Natural Rubber Cap</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-258-107</td><td>Capuchon en caoutchouc pour bouteilles autclave de 1 L</td></tr><tr><td>Dynalon Quick Mist HDPE Sprayer</td><td>Bottles Fisher Scientific</td><td>03-438-12B</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbran Cylindres gradués en polypropylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-44</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbran&nbsp ; Dissection Pince à pointe arrondie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-887</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sachets de stérilisation à scellage instantané</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Straight Broad Strong Tip Pince d’application générale&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-107</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp ; Ruban autoclave sans plomb</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-110</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de gavage, acier inoxydable réutilisable. Droit. Aiguille de calibre 22, diamètre de la pointe 1,25 mm, longueur 38 mm ou 1,5 pouces (doz)</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK 020</td><td></td></tr><tr><td>H-B Instrument Durac Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-202-015</td><td></td></tr><tr><td>Cages et crémaillère IsoPositive (c’est-à-dire isocages)</td><td>Tecniplast&nbsp ; &nbsp ;</td><td>ISO30P</td><td>30 cages (6 l x 5 h), gants en</td></tr><tr><td>nitrile résistant aux produits chimiques à une face Taille S (7), M (8) ou L (9) 18" de long, 22 mil, Ansell</td><td>Grainger</td><td>4T426</td><td></td></tr><tr><td>Gants d’examen en nitrile, moyens, non stériles, non poudrés</td><td>MedSupply Partners</td><td>KG-1101M</td><td></td></tr><tr><td>Gaz à baïonnette olive / magenta et Cartouches vapeur / Filtre à particules 2Ct&nbsp ;</td><td>&nbsp ; 3M/Fastenal</td><td>50051138541878</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate RadDisk Mini pour souris 8-75 x 4</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td></td></tr><tr><td>Capuchons bouffants en polypropylène - 24", bleu</td><td>Uline</td><td>S-10480BLU</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Cary-Blair moyen, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-646</td><td></td></tr><tr><td>S, M et L Harnais de tête bimode en silicone bleu demi-masque Respirateur&nbsp ;</td><td>&nbsp ; Gants</td><td></td> stériles en latex non poudrés série 3M/Fastenal 50051131370826 <td></td></tr><tr><td>SGPF, CT International, Épaisseur = 6,5 mm, Longueur = 30,5 cm (12), Taille du gant = 8,5, Couleur du gant = Blanc</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-102F</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-chaussures antidérapants</td><td>Uline</td><td>&nbsp ; S-25639</td><td></td></tr><tr><td>Blouse chirurgicale, serviette, stérile, grande, 32/cs</td><td>Thomas Scientific</td><td>KIM 95111</td><td></td></tr><tr><td>Teklad Global 18 % de protéines extrudées pour rongeurs (stérilisable)&nbsp ;</td><td>Inotiv</td><td>2018SX</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Réservoir LLDPE rectangulaire à usage intensif avec couvercle (volume de 20 L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-831-330J</td><td></td></tr><tr><td>VERIFY Dual Species Indicateurs biologiques autonomes</td><td>Steris Healthcare</td><td>S3061</td><td></td></tr><tr><td>WypAll L40 1&frasl ; Essuie-glaces 4 plis</td><td>Uline</td><td>S-8490</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation et maintenance d’une expérience de cage bio-exclusion isopositive pour la transplantation fécale humaine chez des souris exemptes de germes

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

Des échantillons de matières fécales humaines, regroupés selon le phénotype ICI répondeur et non-répondeur (précédemment décrit dans le protocole), ont été gavés chez des souris GF-WT mixtes logées dans 3 isocages par groupe (n = 1-2 souris/cage, n = 6 pour le répondeur et n = 5 pour le non-répondeur). Les souris ont été autorisées à s’acclimater pendant 1 semaine après le transfert. Des échantillons de matières fécales ont ensuite été prélevés sur ces souris (conditions exemptes de germes). Les souris ont ensuite été ga...

Préparation et maintenance d’une expérience de cage bio-exclusion isopositive pour la transplantation fécale humaine chez des souris exemptes de germes

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo montre la méthode de génération d’une souris BLT (moelle, foie et thymus) osseuse doublement humanisée avec un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome intestinal stable de type humain.

Génération d’un modèle murin BLT (Os-Marrow, Foie, Thymus) doublement humanisé

Cette vidéo illustre une procédure de transplantation de microbiote fécal chez une souris déficiente en interleukine-10 avec une inflammation du côlon. Les microbes fécaux colonisés dans l’intestin libèrent des métabolites secondaires, provoquant la libération de cytokines anti-inflammatoires et réduisant l’inflammation du côlon.

Évaluation des effets de la transplantation de microbiote fécal chez une souris déficiente en interleukine-10

La caractérisation quantitative des lymphocytes intestinaux suscite un intérêt croissant en raison de la reconnaissance croissante du fait que ces cellules jouent un rôle essentiel dans diverses maladies intestinales et systémiques. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler des populations de cellules uniques de différents compartiments de l’intestin grêle pour une caractérisation ultérieure de la cytométrie en flux.

L&#39;isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l&#39;intestin grêle Lymphocytes murine

Nous décrivons une nouvelle méthode pour produire des blT-souris doublehumanisées qui comportent un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome d'intestin humain-comme un homme stable. Ce protocole peut être suivi sans avoir besoin de souris exemptes de germes ou d'installations gnotobiotiques.

Un modèle double humanisé DE BLT-souris avec un microbiome humain stable-comme l'intestin et le système immunitaire humain

L’interaction de la susceptibilité génétique, de l’immunité muqueuse et de l’environnement microécologique intestinal est impliquée dans la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Dans cette étude, nous avons appliqué la transplantation de microbiote fécal à des souris déficientes en IL-10 et étudié son impact sur l’inflammation colique et la fonction cardiaque.

Évaluation thérapeutique de la transplantation de microbiote fécal dans un modèle murin déficient en interleukine 10

L’objectif ici est de définir un protocole pour étudier les mécanismes de la dysbiose dans les maladies cardiovasculaires. Cet article explique comment collecter et transplanter de manière aseptique des échantillons fécaux murins, isoler les intestins et utiliser la méthode « Swiss-roll », suivie de techniques d’immunomarquage pour interroger les changements dans le tractus gastro-intestinal.

Isolement fécal murin et transplantation de microbiote

Ici, nous décrivons la structure et les procédures de fonctionnement, y compris les mesures de confinement microbien d’une installation pour les « souris sauvages » en utilisant des prélèvements sanguins pour l’immunophénotypage à titre d’exemple.

Procédures d’exploitation et de bioconfinement d’une installation pour souris de laboratoire avec un microbiome naturel : procédure d’immunophénotypage

Ce protocole détaille l’assemblage de réseaux de mini-bioréacteurs à utiliser pour la culture en flux continu de communautés fécales complexes dans des conditions anaérobies. Nous discutons également des méthodes d’assemblage, d’inoculation et d’échantillonnage des réacteurs pour une analyse plus approfondie.

Ensemble de bioréacteur pour la culture continue de communautés fécales complexes

Ce protocole décrit les étapes nécessaires à la colonisation de souris avec pks+ Escherichia coli dans des conditions non inflammatoires, ainsi que des méthodes non invasives pour la validation de la colonisation et l’évaluation de l’expansion de pks+ E. coli dans les selles.

Colonisation avec Escherichia coli murine pks+ dans des conditions non inflammatoires

Des études de Lyme recherche sur les maladies nécessitent souvent de génération de tiques infectées par l'agent pathogène Borrelia burgdorferi, un processus qui prend généralement plusieurs semaines. Ici nous démontrons une procédure basée sur la microinjection tic infection qui peut être accompli en quelques heures. Nous démontrons également une méthode d'immunofluorescence pour la localisation in situ de B. burgdorferi dans les tiques.

Méthodes de transfert rapide et la localisation des agents pathogènes dans l&#39;intestin de Lyme Tick

Découvrez la transplantation fécale chez des souris exemptes de germes à l'aide de cages ISO positives. Cette méthode permet d'étudier le rôle du microbiome dans le cancer et de valider des relations causales en recherche oncologique.

Préparation et maintenance d’une expérience de cage bio-exclusion isopositive pour la transplantation fécale humaine chez des souris exemptes de germes (Vidéo) | JoVE Journal

Préparation et maintenance d’une expérience de cage bio-exclusion isopositive pour la transplantation fécale humaine chez des souris exemptes de germes

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