Ensemble de bioréacteur pour la culture continue de communautés fécales complexes

Nous étudions les interactions entre les bactéries de l’hôte et la façon dont les facteurs intrinsèques et extrinsèques influencent la santé, en mettant l’accent sur les effets bactériens sur le développement, la progression et la réponse au traitement du cancer. Nous avons étudié les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire anti--1 dans les communautés bactériennes, et nous avons constaté que les métabolites bactériens améliorent l’efficacité du traitement anti--1.

Il est difficile d’isoler l’impact des facteurs de l’hôte sur le microbiome in vivo en raison de multiples influences. Le réseau de microbioréacteurs permet un examen contrôlé de processus spécifiques, clarifiant leurs effets directs sur les communautés microbiennes. Ce protocole offre une méthode rentable pour cultiver des communautés fécales dans des conditions contrôlées tout en permettant aux chercheurs de mener des expériences en parallèle relativement rapidement.

[Instructeur] Pour commencer, procurez-vous un réseau de réacteurs à six puits imprimé en 3D. Coupez douze bandes de 25 millimètres dans un tube en PTFE de 1/8 de pouce et utilisez un rasoir pour raser les pointes. Insérez une extrémité de chaque bande dans l’ouverture du filetage d’un Luer mâle avec un raccord à filetage de 25 à 28. Vissez solidement les raccords dans les ouvertures désignées pour les déchets et les échantillons du réseau. Maintenant, insérez une barre de micro-agitation dans chaque puits du réacteur. Vissez un raccord fileté mâle 1/4-28 dans les trous de source de chaque puits du réacteur. Vissez les raccords d’adaptation de barre de tuyau Luer femelle dans les raccords filetés pour les raccords de déchets et de source de chaque puits de réacteur. Vissez ensuite les raccords d’adaptateur cannelé de tuyau femelle Luer X sur 3-32/2 pouces dans les raccords filetés 1/4-28 pour les ports d’échantillon. Placez un septum en caoutchouc sur les adaptateurs de cannelure du tuyau et repliez le haut. Ensuite, coupez deux ensembles de tubes E-LFL de 2,06 millimètres pour les conduites de déchets et de source. Utilisez de l’eau chaude pour ramollir le tube afin de faciliter la fixation. Fixez le tube au Luer X femelle aux raccords d’adaptateur cannelé de tuyau de 1/8 de pouce pour les raccords de source et d’évacuation. Fixez maintenant un Luer mâle avec une bague de verrouillage X à un adaptateur de tuyau cannelé de 1/8 de pouce à l’autre extrémité du tube. Vissez un adaptateur de tuyau cannelé Luer X femelle à 1/16e de pouce qui s’y adapte. Connectez le tube à deux arrêts de taille appropriée aux raccords de source et d’évacuation correspondants. Fixez ensuite un autre adaptateur de tuyau cannelé Luer X femelle à 1/16e de pouce à l’autre extrémité du tube. Après avoir répété cette opération pour tous les raccords de source et d’évacuation, insérez un Luer mâle avec bague de verrouillage X sur des raccords d’adaptateur de tuyau cannelé de 1/8 de pouce à un morceau de tube E-LFL 2. Fixez une extrémité à l’adaptateur de tuyau cannelé Luer X femelle inoccupé à 1/16e de pouce à l’extrémité de chaque section de tube à deux arrêts pour toutes les pièces. Après avoir répété cette opération pour tous les raccords de source et de déchets, connectez le tube E-LFL de 2,06 millimètres pour les conduites de source des puits un et deux du réacteur, en utilisant les extrémités opposées d’un Luer T femelle. Fixez ensuite un morceau de tube de cinq centimètres avec un Luer mâle avec bague de verrouillage X à des raccords adaptateurs de 1/8 de pouce à chaque extrémité de la sortie centrale du T, menant à une deuxième jonction en T. Connectez maintenant le tube de source E-LFL 2,06 millimètres pour le troisième réacteur au côté opposé du deuxième T. Fixez un autre segment de tube de cinq centimètres ayant un Luer mâle avec bague de verrouillage X vers un adaptateur 1/8 de pouce à une extrémité et un Luer femelle avec bague de verrouillage X vers un adaptateur de 1/8 de pouce à l’autre. Ensuite, fixez un Luer mâle avec bague de verrouillage X à un raccord d’adaptateur de tuyau cannelé de 1/8 de pouce à une extrémité d’un morceau de 25 centimètres de tube E-LFL de 2,06 millimètres. Fixez un raccord d’adaptateur de tuyau cannelé Luer X femelle à 1/8 de pouce à l’autre extrémité et couvrez-le avec du papier d’aluminium. Pour assembler la bouteille de collecte des déchets, fixez sans serrer un bouchon à deux trous sur une bouteille de deux litres. Insérez les raccords filetés mâles 1/4-28 dans les deux trous du capuchon. Fixez ensuite un Luer femelle avec un adaptateur de tuyau cannelé de 1/8 de pouce au raccord fileté mâle qui ne se connecte pas au tube en PTFE pré-attaché dans le capuchon. Connectez un morceau de cinq centimètres de tube E-LFL de 2,06 millimètres à l’adaptateur de cannelure de tuyau sur la bouteille. Fixez un Luer mâle avec bague de verrouillage X à un adaptateur de cannelure de tuyau de 1/8 de pouce à l’autre extrémité du tube avant de le recouvrir d’une feuille d’aluminium. Enfin, couvrez tout le bouchon de la bouteille avec du papier d’aluminium avant de l’autoclaver à 121 degrés Celsius et 15 psi pendant 45 minutes. Une fois l’autoclave terminé, serrez les raccords et les joints d’aluminium et placez les réacteurs dans une chambre anaérobie pendant 48 heures avant de les utiliser. Alignez le réseau de réacteurs à l’intérieur de la chambre anaérobie sur une plaque d’agitation magnétique réglée à 1 600 tr/min. Montez ensuite le tube à deux arrêts pour les conduites de source et d’évacuation dans les colliers des pompes péristaltiques correspondantes. Verrouillez les pinces en place si cela est fait moins de 25 heures avant l’utilisation. Sinon, laissez-le lâche pour réduire l’usure du tube. Retirez maintenant le bouchon en aluminium de la bouteille source. Vissez les raccords dans les raccords filetés Luer à 1/4-28, en vous assurant que ces ouvertures sont connectées au tube interne en PTFE. Retirez les bouchons en aluminium et fixez un filtre à seringue de 0,22 micromètre à la ligne d’aération de cinq centimètres de la bouteille source et de la bouteille de déchets. Commencez l’écoulement à un débit modéré pour commencer à remplir le réacteur. S’assurer que le tube de taille à l’intérieur de chaque puits du réacteur est positionné plus bas que le tube source pour éviter le débordement ou la vidange complète de chaque puits. Lorsque les réacteurs commencent à se remplir, vérifiez que tous les puits atteignent le même volume et que le fluide s’écoule dans la ceinture avant de laisser les réacteurs dégazer pendant la nuit. Commencez par transférer le matériel expérimental dans la chambre anaérobie pendant 24 heures. Après avoir calculé la quantité d’inoculum fécal nécessaire, transférez les échantillons fécaux conservés dans des flacons cryogéniques dans la chambre anaérobie et laissez-les décongeler pendant 15 minutes. À l’aide d’une pointe de pipette à large diamètre, transférez les matières fécales des flacons cryogéniques dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez le tube scellé à 200 g pendant cinq minutes pour décanter les particules. Transférez les tubes dans la chambre anaérobie. Retirez ensuite le surnageant. À l’aide d’une spatule de laboratoire autoclave, transférez les 5,7 grammes de matières fécales dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ajoutez 17,1 millilitres de solution saline stérile anaérobie dans le tube et fermez hermétiquement. Maintenant, faites tourbillonner le tube pendant cinq minutes avant de le centrifuger comme démontré précédemment. Utilisez une lingette de laboratoire à 10 % d’eau de Javel pour stériliser les septa sur le dessus de chaque réacteur pendant au moins deux minutes. Après avoir renvoyé les échantillons dans la chambre anaérobie, pipetez le surnageant vers de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres. Transférez maintenant 3,8 millilitres de surnageant de boue fécale dans six seringues distinctes de cinq millilitres équipées d’aiguilles de calibre 16 et de 1,5 pouce. Retirez la lingette à l’eau de Javel des septa du réacteur. Ensuite, insérez l’aiguille dans le septum et injectez lentement 3,8 millilitres de boue fécale dans chaque réacteur avant de laisser les réacteurs reposer toute la nuit. Après une incubation de 16 à 18 heures, démarrez l’écoulement vers le réacteur. Réglez la plaque d’agitation magnétique à la vitesse maximale immédiatement après l’injection de la boue fécale. La composition de la communauté microbienne dans les deux réacteurs répétés a changé au fil du temps, les différentes espèces montrant une abondance relative variable d’un jour à l’autre. Des bactéries anaérobies exigeantes, telles que Clostridium genera, ont été systématiquement détectées dans chaque réacteur à tous les points temporels.