Name: Imagerie de transfert d’énergie par résonance de Förster en direct de la dynamique d’activation d’Akt régulée métaboliquement dans les cellules HepG2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Découvrez l'imagerie FRET pour visualiser l'activation d'Akt dans les cellules HepG2 en temps réel. Cette méthode révèle la dynamique spatiotemporelle de la signalisation insulinique et de la régulation métabolique dans les cellules cancéreuses.

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<table><tbody><tr><td>0,25 % trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>Réf. #25200-056</td><td>Utilisez du PBS glacé pour le lavage des cellules</td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire à fond en verre de 15 mm</td><td>NID</td><td>Réf. #801001</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp ; mL de flacons cryogéniques Nalgene</td><td>Thermo Scientific</td><td>Réf. #5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>5 mL de pipettes sérologiques Stripette</td><td>Corning</td><td>Réf. #4487</td><td></td></tr><tr><td>95 % d’éthanol</td><td>Kermel</td><td>Réf. #C028005</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal A1 HD25/A1R HD25</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td>Grossissement : 40 fois, Ouverture numérique (NA) : 1,30, Temps de séjour des pixels : 2,4 ms, Taille des pixels : 1024</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N° de catalogue#A9393</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>VWR Sciences de la vie</td><td>Chat#N208-10g</td><td></td></tr><tr><td>Corning 25&nbsp ; CM2 flacons de culture rectangulaires</td><td>Corning</td><td>N° de Cat#430639</td><td></td></tr><tr><td>Compteur automatique de cellules Countess 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage de cellules Countess</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.thermofisher.com/#C10228</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeurs vortex numériques</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. #D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5&nbsp ; Ml</td><td>Eppendorf</td><td>Réf. #022363204</td><td></td></tr><tr><td>Kit de détection de mycoplasmes EZ-PCR</td><td>Industries biologiques</td><td>Réf. # 20-700-20</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin, qualifié, Australie</td><td>Gibco</td><td>Réf. #10099141</td><td></td></tr><tr><td>Supplément GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>Réf. #35050061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>Logiciel GraphPad</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>Collection nationale de cultures cellulaires authentifiées</td><td>#CSTR :19375.09.3101HUMSCSP510&nbsp ; http://www.cellbank.org.cn/</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion Type 37</td><td>Laboratoires Cargille</td><td>Chat #16237</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. #I5500-50MG</td><td>Chaud à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Bouillon LB (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>Réf. #10855001</td><td></td></tr><tr><td>Support Essentiel Minimum (MEM)</td><td>Gibco</td><td>N° de chat#11095080</td><td>Chaud à 37 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>mySPIN 12&nbsp ; Mini centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com</td><td></td></tr><tr><td>Objectif à huile Nikon Plan Fluor 40&times ;/1.30</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements-AR</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels (NEAA) (100x)</td><td>Gibco</td><td>N° de catalogue #11140050</td><td></td></tr><tr><td>Plaques d’agar One Shot LB&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>N° de catalogue#A55802</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 chimiquement compétent E.&nbsp ; Coli</td><td>Invitrogen</td><td>Réf. #C737303</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>Réf. #B8R05606</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate)</td><td>Gibco</td><td>Réf. #10010023</td><td></td></tr><tr><td>pEevee-iAkt-NES (7 033&nbsp ; bp)</td><td>Miura et&nbsp ; al31</td><td>https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>Réf. #15070063</td><td></td></tr><tr><td>Prophylaxie de la plasmocine</td><td>InvivoGen</td><td>Cat#fourmi-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Bromhydrate de poly-L-lysine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Réf. : #P4832</td><td></td></tr><tr><td>Bains de précision à usage général</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep kit miniprep d’essorage</td><td>QIAGEN</td><td>Réf. #27106</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>SnapGene par Dotmatics</td><td>https://www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>Réf. #11360070</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtre à seringue, 0,22&nbsp ; &mu ; m</td><td>Millipore</td><td>N° de catalogue #SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur Tokai Hit stage top</td><td>SUCCÈS DE TOKAI</td><td>https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée sans DNase/RNase ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>N° de catalogue #10977015</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection Xfect</td><td>Biographie de Takara</td><td>Réf. #631317</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie de transfert d’énergie par résonance de förster en direct de la dynamique d’activation d’akt régulée métaboliquement dans les cellules hepg2

Live-Cell F&#246;rster Resonance Energy Transfer Imaging of Metabolically Regulated Akt Activation Dynamics in HepG2 Cells

Pour étudier l’activation d’Akt dans les cellules HepG2, les cellules ont été ensemencées sur des boîtes d’imagerie pré-enrobées et transfectées avec le biocapteur basé sur FRET pEevee-iAkt-NES (Figure 2A), conçu pour permettre la surveillance en temps réel de la phosphorylation d’Akt. Après la transfection, les cellules ont subi une famine sérique pendant 4 heures dans un milieu sans sérum afin de synchroniser leur état métabolique et de minimiser la signalisation basale de l’insuline.
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Imagerie de transfert d’énergie par résonance de Förster en direct de la dynamique d’activation d’Akt régulée métaboliquement dans les cellules HepG2

Metabolically regulated Akt activation is a critical node in the insulin signaling cascade and provides valuable insights into the relationship between ...

L’hétérogénéité cellulaire est un obstacle à la description précise des subtilités de la dynamique cellulaire, qui sont essentiellement moyennées. C’est pourquoi nous sommes ici pour imager des cellules uniques. Les développements récents dans les biocapteurs FRET génétiquement codés ont amélioré la spécificité et révolutionné le suivi en temps réel d’Akt dans les cellules, ce qui est essentiel à la compréhension de l’hétérogénétique et au développement de thérapies médicamenteuses personnalisées.Le cancer et le diabète sont le fait de voies métaboliques complexes. Pour décoder la biocomplexité de la voie de signalisation de l’insuline dans le cancer, nous utilisons l’imagerie FRET de cellules vivantes de pointe à une résolution de cellule unique. Nous avons constaté que l’optimisation du microscope confocal, de la configuration matérielle et logicielle, ainsi que le réglage précis de la puissance laser et l’ajustement du gain du détecteur, sont essentiels pour minimiser le bruit et la diaphonie spectrale dans les signaux FRET.Les méthodes traditionnelles en vrac comme le western blot manquent de détails spatio-temporels et masquent l’hétérogénéité cellulaire. Notre protocole comble cette lacune en utilisant l’imagerie FRET de cellules vivantes pour capturer la réponse cellulaire avec une précision et une exactitude élevées. Pour commencer, ajoutez un millilitre d’une solution de poly-L-lysine de 0,1 milligramme par millilitre dans une boîte d’imagerie et secouez la boîte pour couvrir toute la surface.Après une nuit d’incubation, aspirez l’excès de solution de Poly-L-lysine de la boîte. Rincez doucement la surface avec du PBS 3 fois, en laissant reposer pendant cinq minutes chacune pour éliminer complètement la poly-L-Lysine non liée. Aspirez le PBS et séchez à l’air libre la parabole d’imagerie revêtue à 37 degrés Celsius pendant au moins trois heures.Ensuite, ensemencez les cellules HepG2 dans la boîte d’imagerie pré-enrobée 24 à 48 heures avant la transfection pour vous assurer qu’elles atteignent 70 à 90 % de confluence. Décongelez et vortex le réactif de transfection ainsi que le plasmide codant pour le biocapteur de transfert d’énergie par résonance de Forster. Effectuez un court essorage pour recueillir tout le mélange au fond du tube.Mélangez huit microgrammes du plasmide avec le tampon de réaction jusqu’à un volume final de 100 microlitres à l’aide d’un vortex pendant cinq secondes à grande vitesse. Effectuez une courte rotation pour recueillir le mélange au fond du tube. Ajoutez 2,4 microlitres de polymère de transfection dans le tube contenant l’ADN plasmatique dilué et mélangez bien.Incuber le mélange de biocapteur et de polymère à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre la formation de complexes de nanoparticules. Faites tourner le tube pendant cinq secondes à 5 000 G pour recueillir le contenu au fond. Ajoutez la totalité des 100 microlitres de solution complexe de nanoparticules goutte à goutte dans le milieu de culture cellulaire et balancez doucement la plaque d’avant en arrière pour mélanger.Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant quatre heures à toute la nuit. Après avoir retiré les complexes de nanoparticules des cellules, remplacez la solution par deux millilitres de milieu de croissance complet frais. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’au moment de l’analyse.Analysez les cellules sous microscopie à fluorescence. Retirez le milieu de culture de la boîte d’imagerie et rincez-la deux fois avec 1X PBS, en laissant chaque rinçage durer cinq minutes. Ajoutez deux millilitres de milieu de famine dans chaque plat sur le pourtour du plat.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Ensuite, allumez l’ordinateur, puis allumez l’unité principale du microscope confocal et les accessoires de manière séquentielle. Après cela, activez le système laser en tournant la clé en position marche et en basculant les interrupteurs à bascule de lancement laser.Ensuite, tournez les commutateurs de verrouillage laser dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à la position marche pour les deux lignes laser. Enfin, mettez le contrôleur système sous tension. Lancez le logiciel NIS-Elements AR à partir du bureau.Cliquez sur A1 pour l’acquisition afin de lancer la configuration de l’imagerie et de sélectionner les configurations optiques appropriées en fonction des exigences expérimentales. Installez l’incubateur supérieur de la platine du microscope et fixez-le avec des vis. Remplissez le bain-marie interne avec de l’eau stérile bidistillée.Ensuite, installez le chauffage supérieur et allumez l’alimentation électrique du chauffage de scène, du chauffage du bain et du chauffage de l’objectif. Essuyez l’objectif d’immersion dans l’huile 40X avec du papier d’objectif imbibé d’éthanol à 95 % et placez une petite gouttelette d’huile d’immersion sur l’objectif de l’objectif. Ensuite, placez la boîte d’imagerie contenant les cellules HepG2 sur la platine du microscope et fixez-la avec le support.Fermez la chambre et incubez les cellules pendant une à deux heures pour permettre l’équilibre. Lancez la fenêtre d’acquisition ND à partir du menu Fichier de NIS-Elements AR. Sélectionnez l’onglet Temps pour définir l’intervalle, la durée et les boucles de l’imagerie en accéléré. Cliquez sur l’onglet XY et appuyez sur le bouton Ajouter pour inclure les cellules HepG2 pour l’imagerie sous la mise au point.Ensuite, cochez la case Z pour définir la position Z. Cliquez sur Parcourir pour sélectionner un dossier de destination. Entrez le nom de l’expérience dans la zone Nom de fichier.Cliquez sur Exécuter maintenant pour lancer l’acquisition et démarrer le processus d’imagerie en accéléré. Enregistrez les mesures de base jusqu’à 30 minutes sans milieu supplémenté en insuline. Interrompez l’imagerie à intervalles réguliers.Retirez délicatement le milieu de la boîte à fond de verre et ajoutez un millilitre de milieu complété par la concentration d’insuline appropriée. Reprenez l’acquisition de l’image et cliquez sur Terminer à la fin de l’expérience pour fermer. Enfin, sauvegardez et stockez en toute sécurité les images acquises pour analyse.Une augmentation dose-dépendante de la phosphorylation d’Akt a été observée lors de la stimulation à l’insuline, avec une forte augmentation à 300 insuline picomolaire. Au-delà de cette concentration, les niveaux de phosphorylation ont plafonné et n’ont pas baissé même après la diminution de l’insuline. Le rapport FRET normalisé a montré une tendance similaire, avec un signal croissant lors de la stimulation de l’insuline et un échec de retour à la ligne de base lors du retrait de l’insuline.Lors d’une stimulation séquentielle à l’insuline, une augmentation progressive du rapport FRET normalisé a été observée, soutenant la réponse d’activation d’Akt dose-dépendante.

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Découvrez l'imagerie FRET pour visualiser l'activation d'Akt dans les cellules HepG2 en temps réel. Cette méthode révèle la dynamique spatiotemporelle de la signalisation insulinique et de la régulation métabolique dans les cellules cancéreuses.

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