Une approche simplifiée pour la protéomique basée sur la spectrométrie de masse à l’aide de régions tissulaires sélectionnées

Nous avons développé une méthode simplifiée pour étudier le protéome dans des régions spécifiques d’échantillons de tissus supérieurs à l’aide de la spectrométrie de masse. Notre objectif est d’améliorer la technique protéomique, y compris la préparation d’échantillons et l’analyse par spectrométrie de masse, afin d’atteindre une précision et une fiabilité élevées. L’un des défis de la protéomique spatiale basée sur la FFPE est la digestion incomplète des protéines, ce qui réduit la couverture globale des protéines.

Pour les surmonter, il faut des protocoles de digestion optimisés et des stratégies de spectrométrie de masse améliorées pour améliorer la profondeur et la précision du protéome. Nous avons identifié des altérations protéiques distinctes dans différents types de maladies pancréatiques, ce qui nous a permis de mieux comprendre les différences entre les états bénins et précancéreux. Ces résultats pourraient aider au diagnostic précoce du cancer du pancréas.

Notre objectif est de faire progresser la méthode de protéinase du patient afin d’obtenir une cartographie protéique à haute résolution dans les régions tissulaires. En utilisant la protéomique basée sur la spectrométrie de masse, nous cherchons à identifier des signatures moléculaires spécifiques à une région qui contribuent à la découverte de biomarqueurs. Notre approche intègre ces pièges et la pré-préparation du patient avec la spectrométrie de masse d’occasion indépendante des données pour générer rapidement des données de protéome de haute qualité à partir de régions tissulaires FFPE sélectionnées.

Cette méthode permet une grande quantification du protéome spatial. Pour commencer, préparez une lame de tissu colorée à l’hématoxyline et à l’éosine ou immunohistochimique avec la région d’intérêt indiquée par un pathologiste. Placez la lame de tissu non coloré et la lame de tissu coloré dos à dos, en assurant un bon alignement.

À l’aide d’un scalpel, retirez les régions tissulaires qui ne sont pas d’intérêt et grattez les régions tissulaires d’intérêt vers le centre de la lame. Transférez le tissu collecté dans un tube propre de 1,5 millilitre à faible teneur en protéines et ajoutez 180 microlitres de tampon de lyse SDS dans chaque tube. Effectuez la sonication de la sonde à 20 % d’amplitude pendant 10 cycles de cinq secondes de marche et cinq secondes de désactivation.

Maintenant, incubez les échantillons à 100 degrés Celsius pendant 3,5 heures tout en maintenant une vitesse de 1 000 g.Après l’incubation, laissez l’échantillon refroidir à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez à 16 000 G pendant 10 minutes à température ambiante pour séparer les débris tissulaires du surnageant. Recueillir le surnageant dans un tube étiqueté propre et le conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé à nouveau.

Pour la précipitation de l’acétone, placez l’échantillon de protéines correspondant à 100 à 300 microgrammes dans un tube compatible avec l’acétone. Ensuite, ajoutez de l’acétone glacée, pré-refroidie à moins 20 degrés Celsius, dans un volume cinq fois supérieur au volume de l’échantillon. Incuber le mélange à moins 20 degrés Celsius pendant 18 heures.

Après l’incubation, centrifugez le tube à 16 000 G pendant 15 minutes. Éliminez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille de protéine. Ajouter 500 microlitres d’acétone tempérée à moins 20 degrés Celsius et centrifuger.

Après avoir décanté le surnageant, faites sécher l’échantillon à l’air. Préparez le tampon de lyse de piégeage en suspension dans de l’eau déminéralisée. Ensuite, ajoutez 40 microlitres du tampon préparé dans le tube d’échantillon et tourbillonnez soigneusement pour dissoudre la pastille de protéine séchée à l’air.

Placez l’échantillon dans un incubateur à agitation à 100 degrés Celsius à 1 000 g pendant 35 minutes. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de réactif alkylant à l’échantillon et incubez l’échantillon à température ambiante à 300 G pendant une heure. À l’intérieur d’une hotte chimique, ajoutez cinq microlitres d’acide trichloracétique à 10 % à l’échantillon, ce qui porte le volume total à 55 microlitres.

Vérifiez le pH de l’échantillon à l’aide d’un papier pH pour vous assurer qu’il est inférieur à un. Ensuite, ajoutez 350 microlitres de tampon de liaison à l’échantillon pour piéger les protéines. Placez la colonne de piégeage en suspension dans un tube de deux millilitres et transférez l’échantillon entier, y compris tout matériau insoluble, dans la colonne.

Centrifugez la colonne à 4 000 G pendant 50 secondes pour piéger les protéines. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de tampon de lavage deux. Après la centrifugation, jetez le flux.

Après le lavage final, centrifugez la colonne à 4 000 G pendant 1,25 minute pour assurer le passage complet du premier tampon. Ajoutez 125 microlitres de tampon de digestion à la colonne de piégeage en suspension et bouchez-la pour éviter l’évaporation. Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 18 heures sans agiter.

Maintenant, ajoutez 80 microlitres de tampon d’élution à la colonne de piégeage en suspension et centrifugez à 4 000 G pendant 1,25 minute. Tirez sur les peptides élués et transférez-les dans un nouveau tube propre. Après la quantification des peptides, lyophilisez 20 microgrammes de peptides.

Dissoudre à nouveau les peptides lyophilisés dans 40 microlitres de tampon aqueux contenant 3 % d’acétonitrile dans de l’eau d’acide formique à 0,1 % et sonicate pendant 10 minutes dans un bain de sonication. Centrifuger l’échantillon à 16 000 G pendant 60 minutes et transférer le surnageant dans des flacons pour l’analyse par spectrométrie de masse. Injectez deux microlitres de chaque échantillon à l’aide de l’échantillonneur automatique du système de spectrométrie de masse par chromatographie nano-liquide.

Séparez les peptides sur une colonne de phase inverse remplie de trois micromètres de matériau C18 en utilisant un gradient de 127 minutes de cinq à 35 % d’acétonitrile à 100 nanolitres par minute. Ionisez les peptides via une source d’ions par nanopulvérisation et transférez-les dans un spectromètre de masse basé sur Orbitrap. Analysez les peptides à l’aide d’une méthode d’acquisition à plage étroite et indépendante des données.

L’isolement précis de la région d’intérêt pendant le traitement des tissus FFPE a été réalisé sur différents tissus pancréatiques kystiques fixés au formol et inclus dans la paraffine. Des chromatogrammes ioniques totaux reproductibles ont été obtenus entre les triréplicats biologiques pour chaque type de néoplasme kystique pancréatique. L’analyse par chromatographie liquide par spectrométrie de masse a permis d’identifier 9 703 protéines.

L’abondance de toutes les protéines identifiées s’étendait sur 6,25 ordres de grandeur, démontrant une couverture complète du protéome, et les marqueurs protéiques connus du cancer du pancréas ont été quantifiés. Au total, 933 protéines exprimées de manière différentielle ont été identifiées, dont 457 régulées à la hausse et 476 à la baisse dans les néoplasmes mucineux papillaires intracanalaires. L’analyse bio-informatique a révélé que les protéines exprimées de manière différentielle étaient associées à plusieurs voies liées au cancer du pancréas.