Génération et caractérisation d’astrocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines dépourvus de ribonucléoprotéine messagère X fragile

Ce travail se concentre sur quatre astrocytes humains spécifiques au cerveau et sur la façon dont ils sont modifiés par des troubles neurodéveloppementaux tels que le syndrome de l’X fragile. Des travaux antérieurs ont utilisé des modèles animaux pour étudier principalement les neurones, de sorte que ce travail ajoute une nouvelle dimension à ce domaine de recherche.

Les connaissances mécanistes issues d’études animales ont rencontré un succès clinique limité. Le principal défi est d’obtenir des informations similaires sur les neurones et les astrocytes d’origine humaine.

Notre protocole a réussi à générer des fonctions pour des astrocytes spécifiques au vent, qui présentent un métabolisme dysrégulé, glycolytique et mitochondrial dans le syndrome de l’X fragile, permettant d’étudier le rôle des cellules gliales dans la biologie de la maladie. Malgré les preuves de plus en plus nombreuses du rôle clé de la glie dans la fonction neuronale dans la santé et la maladie, on sait peu de choses sur la façon dont les astrocytes humains sont affectés dans les troubles neurodéveloppementaux, tels que le syndrome de l’X fragile.

À l’avenir, nous nous appuierons sur ce cadre pour étudier comment les astrocytes et leurs interactions avec les neurones sont modifiés par la maladie, puis comment ceux-ci peuvent être corrigés par des interventions thérapeutiques.

[Instructeur] Pour commencer, enduire un plat à six houles de Matrigel dilué dans un rapport de un à 60 dans du DMMF 12 avancé. Conservez le plat enduit à une température de deux à huit degrés Celsius. Le jour de la culture, retirez le matériau d’enrobage de la boîte et ajoutez un millilitre de milieu essentiel complet, ainsi qu’un inhibiteur de roche à une concentration finale de un X. Placez la boîte dans un incubateur. Réglez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone avant d’ajouter les cellules souches pluripotentes induites par l’homme, ou IPSC. Ensemencer les IPSC humains dans un milieu complet de huit essentiels avec l’inhibiteur de roche à une concentration finale de un X pour améliorer l’adhésion de la colonie. Le lendemain, remplacez le milieu complet Essential Eight par un milieu frais, dépourvu de l’inhibiteur de roche. Continuez à réapprovisionner le milieu quotidiennement jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % de confluence, ce qui prend environ quatre à cinq jours. Lorsque les colonies atteignent 80 % de confluence, ajoutez un mélange de collagénase et de dispase pour les détacher enzymatiquement de la boîte. Une fois que les colonies commencent à se soulever, retirez la boîte de l’incubateur et ajoutez deux millilitres de DPBS pour neutraliser l’activité enzymatique. À l’aide du DPBS, grattez les colonies et recueillez la suspension dans un tube conique de 15 millilitres, à l’aide d’une pipette sérologique à large bande de 10 millilitres. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, triturez doucement la suspension deux à trois fois pour briser les colonies. Laissez les colonies s’installer. Après environ deux minutes, aspirez le mélange d’enzymes DPBS tout en laissant environ un millilitre de liquide dans le tube. Ajoutez ensuite deux millilitres de DPBS dans le tube et mélangez en tapotant doucement pour remettre les colonies en suspension. Laissez-les se déposer et répétez ce processus deux fois pour éliminer l’enzyme résiduelle. Après avoir retiré le surnageant, remettez les colonies en suspension dans un millilitre de milieu essentiel complet et servez-les dans un plat fraîchement préparé enrobé de Matrigel. Soulever enzymatiquement les cellules souches pluripotentes induites par l’homme comme décrit précédemment. Placez-les sur une boîte de culture en suspension non adhérente de 100 millimètres avec un milieu chimiquement défini. Placez la suspension cellulaire sur un agitateur orbital à 40 tours par minute pendant sept jours dans des conditions normoxiques pour faciliter le développement des sphères de cortico. Le huitième jour, transférez les sphères de cortico dans un milieu de prolifération cellulaire et maintenez-les pendant sept jours. Pour induire la spécification gliale, incubez les sphères de cortico dans un milieu d’enrichissement glial pendant deux semaines pour obtenir des sphères gliales précoces. Pour la maturation des sphères gliales précoces, remplacez le facteur de croissance des fibroblastes de base H par 20 nanogrammes par millilitre de facteur inhibiteur de la leucémie et maintenez les sphères pendant quatre semaines.

Après quatre semaines dans un milieu de maturation, continuez à maintenir les sphères dans un milieu d’enrichissement glial pendant de longues périodes. Pour éviter l’agrégation et la perte de viabilité, hachez mécaniquement les sphères gliales toutes les deux semaines, à l’aide d’une lame industrielle stérile. Remplacez le milieu entier par de la DNase pour éliminer les fragments d’ADN générés par le hachage. Ensuite, dissociez les sphères gliales en monocouches de cellules progénitrices d’astrocytes, à l’aide d’un kit de dissociation de la papaïne. Plaquez les cellules dissociées sur une culture cellulaire, une boîte adhérente traitée pré-enrobée de Matrigel à une dilution de un à 80. Propager les cellules progénitrices des astrocytes dans un milieu d’enrichissement glial jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence. Le passage des cellules éliminent le milieu épuisé et le recueillent dans un tube conique. Ajoutez un milieu de détachement de cellules enzymatiques aux cellules et attendez une à deux minutes. Une fois que les cellules commencent à se détacher, ajoutez le milieu épuisé pour neutraliser l’activité enzymatique. Prélever la suspension cellulaire et la centrifuger à 800 G pendant deux minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre les cellules en suspension dans un milieu d’enrichissement glial. Plaquez environ une fois 10 à la puissance six cellules par puits sur une boîte enrobée de Matrigel à une dilution de un à 80. Pour la cryoconservation, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un mélange froid de 90 % de milieu de prolifération de la cortico sphère et de 10 % de cryoprotecteur. Transférez les cellules remises en suspension dans des flacons cryogéniques. Déplacez immédiatement les flacons cryogéniques dans une boîte cryogénique et conservez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, transférez tous les flacons cryogéniques dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme. Caractériser les cellules progénitrices des astrocytes dissociées par immunocoloration avec des marqueurs de Vimenton et de facteur nucléaire IAM. Pour confirmer la spécificité régionale des quatre cerveaux des APC humains dérivés de l’IPSC, effectuez une analyse QPCR en temps réel pour la boîte à tête de fourche humaine G1 et la boîte homéo humaine, B4. Différencier les APC en astrocytes et milieu de différenciation astrocytaire pendant 14 jours. Placez les astrocytes sur une parabole à fond de verre de 35 millimètres à une densité de cinq fois 10 à la puissance trois cellules par parabole pour mesurer leur réponse à l’adénosine cinq triphosphate. Laissez les cellules adhérer au fond du verre pendant 24 heures. Lavez les cellules collées trois fois avec la solution saline équilibrée sans calcium de Hank. Ensuite, incubez les cellules dans le milieu de culture contenant cinq diuréide métrique à rapport micromolaire 2:00 AM et 0,02 % de F127 pluronique pendant une heure à température ambiante. Après avoir lavé les cellules deux fois avec un milieu de culture, remplacez le milieu par deux millimolaires de calcium contenant la solution de sel équilibré de Hank. Imagez les cellules à deux images par seconde, à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 60X sur un microscope inversé à dérive focalisée. Enfin, enregistrer les réponses calciques induites par l’ATP après l’ajout d’ATP à une concentration finale de cinq millimolaires au bout de 25 secondes. Les colonies IPSC humaines ont exprimé des marqueurs pluripotents opt quatre et nano comme confirmé par immuno-marquage. Les APC dérivées du syndrome de l’X fragile et des lignées témoins ont montré des proportions comparables de vimentine et de cellules NFIA positives. Les cellules progénitrices astrocytaires des cellules souches pluripotentes humaines du contrôle et du syndrome de l’X fragile ont montré une régulation positive de Fox G1, par rapport à HOXB4, indiquant une identité du cerveau antérieur. Les astrocytes dérivés de lignées humaines du syndrome de l’X fragile IPSC ont montré un nombre réduit d’expression de GFAP. Les astrocytes témoins et du syndrome de l’X fragile présentaient des transitoires calciques induits par l’ATP, mais le nombre de répondeurs était significativement plus faible dans les astrocytes du syndrome de l’X fragile. L’amplitude maximale du premier transitoire calcique évoqué par l’ATP était significativement plus faible dans les astrocytes du syndrome de l’X fragile par rapport aux cellules témoins. Les astrocytes humains du syndrome de l’X fragile dérivés de l’IPSC ont montré une augmentation de la glycolyse, de la capacité glycolytique et des réserves glycolytiques, mais ont montré une diminution significative de la respiration maximale par rapport aux astrocytes témoins.