Édition de l’épigénome CRISPR dans des cellules humaines à l’aide de la transfection de l’ADN plasmidique et de la nucléofection de l’ARNm

Cette recherche vise à concevoir et à introduire des éditeurs épigénomiques dans des cellules humaines. Pour ce faire, nous fusionnons les effecteurs de la chromatine à dCas9 pour une modulation génique ciblée sans introduire de cassures d’ADN toxiques. Les défis consistent à fournir efficacement des éditeurs d’épigénome dans les cellules et à garantir une spécificité précise de la cible.

De plus, il reste difficile d’obtenir une répression génique stable ou transitoire. Ce protocole évite tout mécanisme de clivage, réduisant ainsi la toxicité et l’instabilité génomique. Il décrit deux méthodes d’administration pour la modulation contrôlée de l’expression génique sans altérations permanentes de la séquence d’ADN.

Ces méthodes peuvent être appliquées pour tester différentes fusions avec dCas9 et pour étudier la biologie de base de la chromatine. Les éditeurs d’épigénome actuels peuvent être utilisés pour des criblages à l’échelle du génome et ont le potentiel d’applications thérapeutiques. Pour commencer, maintenez les cellules K-562 dans un flacon avec un milieu RPMI complété par 10 % de FBS et de pénicilline streptomycine glutamine.

Le jour de la nucléofection, décongelez l’ARNm CRISPRoff dans un tube de microcentrifugation stérile sans ARNASE et agitez doucement le tube. Utilisez deux microgrammes d’ARNm par 2,0 fois 10 à la puissance cinq cellules dans chaque puits d’un tube de bandelette PCR placé sur de la glace. Préparez la solution de nucléofection selon les instructions du fabricant et laissez-la se réchauffer à température ambiante pendant 15 minutes avant la nucléofection.

Récoltez et comptez les cellules K-562 à l’aide d’un compteur de cellules automatisé avec coloration au bleu trypan vivant/mort. Pour la nucléofection dans une cuvette à bandes, aliquote environ deux fois 10 à la puissance de cinq cellules par échantillon dans un tube de microcentrifugation stérile. Centrifugez les cellules à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante.

Jetez le surnageant. Ajoutez du PBS à température ambiante dans la pastille de cellule et centrifugez-la à nouveau à 500 G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans la quantité appropriée de solution de nucléofecteur. Ajoutez le volume calculé de solution cellulaire à deux microgrammes de solution CRISPRoff. Transférez la solution de cellules et d’ARNm dans une cuvette, en veillant à ce que des bulles ne se forment pas, car cela pourrait compromettre l’efficacité de la nucléofection.

Tapotez doucement la Nucleocuvette pour installer les cellules au fond. Ensuite, nucléofictez les cellules à l’aide du système 4D-Nucleofector avec le code d’impulsion approprié. Il peut être nécessaire d’optimiser le code d’impulsion pour différents types de cellules.

Consultez le fabricant si une optimisation supplémentaire est nécessaire. Après la nucléification, ajoutez 80 microlitres de média RPMI dans chaque puits utilisé de la Nucleocuvette. Transférez la suspension cellulaire dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 400 microlitres de média RPMI préchauffé.

Chargez tous les fichiers standard de cytométrie en flux, ou FSC, dans FlowJo en les glissant et en les déposant dans une nouvelle feuille de calcul. Cliquez sur tous les échantillons pour commencer à créer des portes. Ouvrez un échantillon de contrôle en double-cliquant sur le fichier correspondant.

Créez une porte pour les cellules vivantes dans un tracé FSC-A par rapport à SSC-A à l’aide de l’outil polygone. Un onglet de cellules actives doit maintenant apparaître sous le nom de l’échantillon dans la liste de tous les échantillons. Faites un clic droit sur cette porte et sélectionnez Copier l’analyse à regrouper pour appliquer cette porte à tous les échantillons.

Double-cliquez sur la porte des cellules actives pour sélectionner uniquement les cellules actives. Changez les axes en FSC-H au lieu de FSC-A. Dessinez un polygone à contrôler pour des cellules uniques uniquement.

Pour obtenir un guide d’expression des cellules, double-cliquez sur la porte de cellule unique pour sélectionner uniquement les cellules individuelles. Changez les axes en FSC-A au lieu de PE-CF594-A. Dessinez une porte pour guider l’expression des cellules à l’aide de l’outil Polygone.

Double-cliquez sur la dernière porte de configuration, soit des cellules simples, soit des cellules d’expression de guide. Si vous effectuez une transfection plasmidique où l’éditeur d’épigénome code pour une protéine fluorescente bleue, ou fusion BFP, créez une porte pour les cellules BFP positives pour les échantillons du deuxième jour. Créez une porte pour l’expression du rapporteur en traçant BB515-A par rapport à FSC-A pour identifier et contrôler les cellules GFP négatives.

Ensuite, appliquez cette porte à tous les échantillons. Après avoir terminé la configuration du portail, cliquez sur l’éditeur de table dans le panneau supérieur. Faites glisser les populations pour l’analyse, telles que les cellules BFP positives et GFP négatives.

Dans le panneau de l’éditeur de tableaux, cliquez sur créer un tableau et copiez les données avant de les coller dans une feuille de calcul pour les calculs de normalisation. Maintenant, soustrayez le nombre de cellules rapporteures négatives, telles que GFP négative, dans l’échantillon de contrôle de tous les autres échantillons. Cela corrige le silence de fond du journaliste.

Si vous effectuez une transfection, divisez chaque valeur par le pourcentage de cellules BFP positives mesuré le deuxième jour pour normaliser toutes les valeurs au pourcentage de cellules BFP positives, puis multipliez par 100. Cela donne la valeur normalisée de l’efficacité de transfection des cellules modifiées. Tracez les données pour créer des graphiques linéaires qui représentent les changements tout au long de l’édition de l’épigénome.

Pour toutes les expériences d’édition de l’épigénome, un contrôle guide non ciblé est recommandé pour confirmer que les changements au niveau des loci cibles résultent de l’édition de l’épigénome plutôt que d’une surexpression ou d’une liaison non spécifique de l’éditeur d’épigénome. Il est important de considérer la méthode d’administration de l’éditeur d’épigénome. La transfection de l’ADN plasmidique ou la nucléofection de l’ARNm peut être préférée compte tenu du contexte expérimental.

La prise en compte du type de cellule, de la chronologie expérimentale, de la lecture de l’administration et de l’efficacité de l’administration peut avoir un impact sur la méthode d’administration préférée. Les cellules exprimant des niveaux élevés de BFP deux jours après la transfection indiquent une transfection réussie avec l’éditeur d’épigénome. CRISPRoff et CRISPRi montrent tous deux un silençage maximal du gène au cinquième jour après la transfection.

Dans les expériences de nucléofection de l’ARNm, un fort silençage génique est observé au troisième jour après la nucléofection avec CRISPRoff.