Name: Édition de l’épigénome CRISPR dans des cellules humaines à l’aide de la transfection de l’ADN plasmidique et de la nucléofection de l’ARNm (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Découvrez l'édition épigénomique CRISPR dans des cellules humaines par transfection d'ADN plasmidique et nucléofection d'ARNm. Cette méthode modulaire permet une régulation génique ciblée sans cassures toxiques de l'ADN.

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Bien que le contenu génomique de chaque cellule de notre corps soit presque identique, le profil transcriptionnel de chaque type de cellule diffère considérablement. Les modifications épigénétiques de l’ADN et des protéines d’histones sont des régulateurs clés de l’expression transcriptionnelle. L’euchromatine transcriptionnellement active est caractérisée par des marques épigénétiques distinctes par rapport à l’hétérochromatine compacte et transcriptionnellement inactive. Par exemple, les régions hétérochromatiques sont définies par des modifications répressives des histones, y compris la triméthylation sur la lysine 9 de l’histone 3 (H3K9me3), la triméthylation sur la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3) et la méthylation de l’ADN sur les cytosines à côté des guanines (CpG) sur les promoteurs du gène1. Les régions génomiques d’expression génique active sont définies généralement par l’acétylation et la triméthylation des histones sur la lysine 4 de l’histone 3 (H3K4me3)1.
La révolution CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) a généré une multitude d’outils qui permettent la modification programmée des séquences génomiques. La technologie CRISPR est basée sur un mécanisme de défense procaryote capable de cliver les acides nucléiques à des séquences cibles programmables. Les nucléases CRISPR 2,3,4, les éditeurs de base 5,6 et les éditeurs premiers 7,8 peuvent modifier la séquence d’ADN des génomes de mammifères par la découpe de l’ADN et la réparation de ces cassures. Bien qu’efficaces, ces stratégies peuvent provoquer des cassures de l’ADN sur des sites hors cible 9,10 et des mutations structurelles génomiques à grande échelle 11,12,13,14,15. D’autres outils basés sur CRISPR permettent une modulation traitable de l’activation et de la répression des gènes sans modifier la séquence d’ADN sous-jacente. Ces outils exploitent un Cas9 déficient en nucléases (dCas9), permettant la liaison de l’ADN sur des sites cibles dictés par la séquence de l’ARNsg, en combinaison avec des protéines effectrices qui modifient le paysage chromatinique 16,17,18. Les protéines effectrices, telles que les rédacteurs épigénétiques, les lecteurs et les effaceurs, peuvent être directement fusionnées à dCas9 ou recrutées par un échafaudage peptidique fusionné à dCas9, tel que SunTag, ou un échafaudage d’ARN sur l’ARNsg, tel que le système MS2-MCP 16,17,18. Parmi les exemples d’outils de contrôle de transcription programmables, citons l’activation CRISPR (CRISPRa)19,20,21 et l’interférence CRISPR (CRISPRi)22,23. CRISPRa fonctionne en recrutant directement la machinerie de transcription, augmentant ainsi l’expression des gènes transcriptionnels cibles19. En revanche, CRISPRi réprime la transcription en établissant H3K9me3, une marque épigénétique répressive22.
Les progrès de l’édition de l’épigénome ont permis une large utilisation de ces outils dans tous les domaines scientifiques. Les fusions de différents domaines effecteurs et protéines ont élargi la boîte à outils des éditeurs d’épigénome disponibles 18,24,25,26,27,28,29,30. De plus, les éditeurs d’épigénome sont utilisés pour déchiffrer les rôles des modifications épigénétiques 31,32,33,34,35,36, des effecteurs 37,38,39 et des mutations effectrices 28,40,41 dans la régulation des gènes. Plus précisément, CRISPRi et CRISPRa sont utilisés dans les cribles génomiques fonctionnels pour une variété de processus biologiques, y compris la survie cellulaire42 et le destin cellulaire 43,44,45,46,47. De plus, l’édition de l’épigénome présente un potentiel thérapeutique pour l’ingénierie cellulaire ex vivo et les thérapies in vivo 18.
Ici, nous décrivons des méthodes d’application de deux éditeurs d’épigénome basés sur dCas9 pour la répression transcriptionnelle programmable dans des lignées cellulaires humaines : CRISPRi22 et CRISPRoff48. CRISPRi est une fusion de dCas9 avec le domaine répressif KRAB à partir d’une protéine à doigt de zinc telle que ZNF10 (KOX1) et ZIM3 22,23. Lorsque CRISPRi est ciblé sur un promoteur de gène spécifique, le domaine KRAB recrute un écrivain H3K9me3, SETDB1, pour réprimer le gène cible (Figure 1A). Lorsque CRISPRi est exprimé de manière transitoire, le H3K9me3 établi au locus cible n’est pas maintenu et l’expression génique est restaurée au fil du temps32,48. Pour effectuer des knockdowns stables à l’aide de CRISPRi, comme dans les applications de génomique fonctionnelle, l’expression constitutive de CRISPRi dans les cellules avec l’ARNsg est essentielle. Récemment, CRISPRoff a été conçu pour programmer l’édition héréditaire de l’épigénome48. CRISPRoff est une fusion protéique unique de dCas9 vers le domaine KRAB et le complexe ADN méthyltransférase de novo, DNMT3A et DNMT3L. Une impulsion transitoire de CRISPRoff dans les cellules humaines programme le dépôt de H3K9me3 et la méthylation de l’ADN au niveau des gènes ciblés, ce qui conduit à une répression à long terme des gènes cibles par le maintien de la méthylation de l’ADN et de H3K9me3 (Figure 1B)48. De plus, les modifications de l’épigénome peuvent être inversées. Par exemple, un gène qui est silencieux de manière stable par CRISPRoff peut être réactivé par TET1-dCas9 qui peut supprimer enzymatiquement les marques de méthylation de l’ADN au locicible 49.
Ce protocole détaillera deux méthodes d’administration pour l’expression transitoire des éditeurs d’épigénome : la transfection de l’ADN plasmidique et la nucléofection de l’ARNm. De plus, nous expliquons comment utiliser la cytométrie en flux pour évaluer l’efficacité de l’édition de l’épigénome au niveau de deux gènes endogènes, CLTA et CD55. Ces méthodes peuvent être adaptées et appliquées à d’autres expériences d’édition d’épigénome à l’aide d’éditeurs supplémentaires ou peuvent être utilisées pour cibler différents gènes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68089/68089fig01.jpg"> 
Figure 1 : Schéma du mécanisme et du flux de travail d’édition de l’épigénome CRISPRi et CRISPRoff. (A) Schémas linéaires du transgène sgRNA et de l’éditeur d’épigénome CRISPRi. L’ajout de CRISPRi et d’ARNsg permet l’ajout de la marque d’histone répressive H3K9me3 pour faire taire le locus cible. Le niveau le plus élevé de silençage est atteint tôt après l’ajout de CRISPRi, et la cible du gène est généralement réactivée après quelques passages. (B) Schémas linéaires du transgène sgRNA et de l’éditeur d’épigénome CRISPRoff. L’ajout de CRISPRoff à des cellules ciblant un gène d’intérêt conduit à l’ajout de H3K9me3 répressif ainsi qu’à la méthylation de l’ADN aux sites CpG pour faire taire le gène cible. Le silençage par CRISPRoff est héréditaire - le niveau élevé de silençage est atteint tôt pendant la transfection et persiste sur plusieurs divisions cellulaires. (C) Vue d’ensemble de la chronologie de l’édition de l’épigénome par la méthode de transfection. Le jour 0, les cellules sont plaquées pour la transfection. Le jour 1, l’éditeur et le plasmide guide peuvent être introduits dans les cellules par transfection. Le jour 3, l’expression de BFP dans les cellules sera évaluée par cytométrie en flux. Le pourcentage de BFP est utilisé comme facteur de normalisation pour déterminer l’efficacité finale de l’expérience pour chaque condition. À partir du jour 6, les cellules sont analysées pour faire taire le rapporteur d’intérêt, car le niveau de silence le plus élevé sera atteint ce jour-là. (D) Vue d’ensemble de la méthode de transfection dans laquelle l’éditeur d’épigénome et les plasmides d’ARNsg sont ajoutés aux cellules de manière goutte à goutte. (E) Vue d’ensemble de la chronologie de l’édition de l’épigénome via les méthodes de nucléofection. Dans ce protocole, l’ARNm est nucléofection dans les cellules le jour 0. Les cellules sont évaluées pour le silençage le 3e jour post-nucléofection à l’aide d’une analyse par cytométrie en flux. (F) Vue d’ensemble du protocole de nucléofection. Des quantités appropriées de cellules et d’ARNm sont mélangées et ajoutées dans les cuvettes nucléofectrices. Si l’ARNsg est introduit par nucléofection, il peut également être ajouté à ce mélange. Les cuvettes sont placées dans le nucléofecteur, et des codes d’impulsions appropriés sont utilisés pour introduire l’ARNm dans les cellules. Après la nucléofection, les cellules sont plaquées et passées pour une analyse ultérieure. (G) Comparaison entre les stratégies de transfection de plasmide et de nucléofection d’ARNm pour l’édition de l’épigénome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68089/68089fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 96 puits</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond en U à 96 puits Corning</td><td></td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-humain CD55 Anticorps</td><td>BioLegend</td><td>311312</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A1 Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bleach Waxie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11003428432 Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Countess Compteur de cellules automatisé</td><td>Thermo Scientific</td><td>Countess 3</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRoff transfection plasmidique</td><td>Addgene&nbsp ;</td><td></td><td></td>167981</tr><tr><td>Diluant 2 Réactif d’hématologie pour cytométrie en flux (fluide de gaine)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-029-361</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, High</td><td>Glucose Thermo Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Thomas scientific</td><td>1159M35</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville&nbsp ; SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0281111</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE&trade ; T7 ULTRA Kit de transcription</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de bandelettes PCR</td><td>USA Scientific&nbsp ;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>plasmide d’expression de l’ARNsg pLG1</td><td>Addgene&nbsp ;</td><td></td><td></td>217306</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22-400-105</td><td></td></tr><tr><td>SF Lignée cellulaire 96 puits Nucleofector&reg ; &nbsp ; Kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de culture tissulaire</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUVDL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection TransIT-LTI</td><td>Mirus</td><td>MIR 2306</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.25 %)</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr></tbody></table>

Édition de l’épigénome crispr dans des cellules humaines à l’aide de la transfection de l’adn plasmidique et de la nucléofection de l’arnm

CRISPR Epigenome Editing in Human Cells using Plasmid DNA Transfection and mRNA Nucleofection Delivery

Pour toutes les expériences d’édition de l’épigénome, des contrôles appropriés sont essentiels pour évaluer l’efficacité de l’édition de l’épigénome. Nous recommandons d’utiliser un ARNsg de contrôle, qui ne cible aucune séquence du génome humain. L’utilisation d’un contrôle guide non ciblé donnera l’assurance que les changements au niveau des loci cibles sont entraînés par l’éditeur d’épigénome dirigé vers ce site plutôt que par une surexpression de l’éditeur d’épigénome ou une liaison non spécifique. De plus, pour les ...

Édition de l’épigénome CRISPR dans des cellules humaines à l’aide de la transfection de l’ADN plasmidique et de la nucléofection de l’ARNm

Epigenetics refers to chemical modifications of histone proteins and DNA that can regulate the expression of genes. The human epigenome is altered ...

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