Isolement et culture de cellules primaires de Müller rétiniennes chez des rats Sprague-Dawley (SD)

Ce protocole décrit l’isolement et la culture de cellules rétiniennes primaires de Muller à partir de rats SD de Sprague-Dawley, ce qui peut aider la recherche rétinienne dans la communauté scientifique. Le protocole couvre la dissection rétinienne, l’extraction et l’identification des IC, ainsi que les principales considérations de contrôle. Ce protocole établit une méthode efficace, standardisée et coûteuse pour extraire et récupérer les RMC de vos racks SD légaux. Le modèle RMC peut être utilisé pour simuler des états pathologiques tels que le diabète, la normalité et pour aider les effets des médicaments.

[Narrateur] Pour commencer, versez la solution de D-Hank dans deux boîtes de culture en verre de 10 centimètres. Après avoir euthanasié et désinfecté le rat SD nouveau-né, placez-le sur une parabole incurvée stérile. À l’aide d’une pince à épiler, déchirez la peau de la paupière le long de la fissure palpébrale pour exposer le globe oculaire du rat. Tenez la pince à épiler édentée ouverte et parallèle à la fissure palpébrale pour appuyer sur l’orbite. Une fois que le nerf optique est atteint et que le globe oculaire est exposé, fermez la pince à épiler pour soulever et extraire le globe oculaire. Placez maintenant le globe oculaire dans un plat de culture en verre avec la solution de D-Hank. Rincez le globe oculaire et transférez-le dans un autre plat avec la solution fraîche de D-Hank. Ensuite, à l’aide d’une micro-pince ophtalmique incurvée, fixez doucement la région entre la cornée et le nerf optique pour exposer la cornée. Percez la jonction sclérale de la cornée à l’aide de micro-ciseaux cornéens et coupez le long du limbe de manière circulaire. Faites deux incisions sclérales symétriques d’environ deux millimètres de longueur avant de relâcher la pince et de resserrer à la jonction du nerf optique et de la sclérotique. Ensuite, utilisez une deuxième pince pour appuyer doucement près de la racine du nerf optique, en dirigeant la pression vers l’interface du nerf optique cornéen. Lorsque le tissu du cristallin apparaît, retirez-le soigneusement et continuez à appuyer jusqu’à ce que le tissu rétinien émerge. À l’aide d’une pince, transférez le tissu rétinien séparé dans une autre boîte de culture stérile. Ouvrez le couvercle du plat de culture et utilisez une pipette avec une pointe d’un millilitre pour pipeter le tissu rétinien de haut en bas environ 15 fois pour le briser en petits morceaux. Ensuite, incubez le tissu avec un millilitre de trypsine à 0,25 % à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez la boîte de culture de l’incubateur et placez-la sur la paillasse propre. Ajoutez deux millilitres de milieu complet et pipetez doucement pour arrêter la digestion. Filtrez maintenant la suspension cellulaire à travers un tamis en nylon de 300 mailles dans une centrifugeuse de 15 millilitres à deux. Lavez le plat de culture avec le PBS préparé et récupérez la suspension restante. Faites ensuite tourner le tube à 878 G pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez et jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu complet et centrifuger à nouveau à 878 G pendant cinq minutes pour purifier les cellules. Après avoir jeté le surnageant, remettre les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu complet. Prenez une fiole T25 avec trois millilitres de milieu complet et ajoutez un millilitre de suspension cellulaire. Agitez le ballon en croix avant de le placer dans l’incubateur. Après 48 heures d’incubation, retirez le flacon de l’incubateur et placez-le sur la paillasse propre. Jetez le milieu épuisé et lavez la surface adhérente de la cellule trois fois avec un millilitre de PBS, qui contient 1 % de pénicilline et de streptomycine. Ajoutez ensuite cinq millilitres de milieu frais complet et continuez l’incubation jusqu’à ce que la confluence cellulaire dépasse 90 %. Lavez les cellules trois fois avec un millilitre de PBS contenant 1 % de pénicilline streptomycine. Ensuite, incubez les cellules avec un millilitre de solution de trypsine EDTA à 0,25 % pendant une minute et 30 secondes. Maintenant, observez le flacon sous un microscope inversé. Lorsque les cellules apparaissent rondes, détachées et commencent à flotter, ajoutez deux millilitres de milieu de culture complet dans le ballon pour terminer la digestion. Ensuite, à l’aide d’une pipette, aspirez la suspension cellulaire et transférez l’ensemble de la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Rincez la paroi du ballon avec deux millilitres de PBS contenant 1 % de pénicilline streptomycine et ajoutez-le dans le même tube. Centrifugez le tube à 878 G pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié de milieu complet. Enfin, passez les cellules dans un rapport de un à deux ou de un à trois, selon les besoins. Les cellules rétiniennes de Müller de second passage ou RMC présentaient des morphologies en forme d’étoile ou de fuseau avec des noyaux ronds ou ovales et un cytoplasme abondant. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a révélé des cellules fusiformes et en forme d’étoile avec un cytoplasme rose abondant et des noyaux ovales situés au centre interconnectés par de fines structures filamenteuses. La coloration par immunofluorescence des CMR a révélé une forte fluorescence rouge dans les cellules marquées pour la glutamine synthétase et l’aquaporine-4 et une fluorescence vert vif pour CRALBP, Kir4.1 et Vimentin. NeuN, le témoin négatif n’a pas été détecté dans l’analyse d’immunofluorescence confirmant la spécificité de l’isolement du RMC. L’analyse par cytométrie en flux a montré que 98,7 % des cellules étaient positives pour la glutamine synthétase et 97 % étaient positives pour la CRALBP, indiquant une grande pureté des CMR.