Extraction d’ADN basée sur la matrice pour un séquençage ciblé de nouvelle génération sur des échantillons d’expectorations décontaminés

Notre recherche vise à réduire le délai d’exécution du diagnostic de la tuberculose et de l’initiation ultérieure en intégrant le NGS pour des soins personnalisés aux patients. Notre protocole optimise TNGS pour une utilisation de routine en abordant l’intégration du flux de travail, les coûts et les délais d’exécution, dans le but de réduire les retards de diagnostic et d’améliorer l’initiation rapide du traitement.

Ce protocole permet une extraction rentable, rapide et de qualité suffisante de l’ADN à partir d’échantillons cliniques en quelques heures par rapport aux méthodes CTAB conventionnelles, qui prennent jusqu’à trois jours.

Nos résultats soulèvent des questions clés sur l’intégration du TNGS dans les diagnostics de routine et l’optimisation des méthodes d’extraction pour les échantillons à frottis négatif et peu abondants afin d’améliorer la sensibilité et l’utilité clinique. Nous explorerons si les échantillons restants des diagnostics de routine peuvent être utilisés pour le séquençage en aval, y compris le séquençage direct du génome entier des expectorations afin de rationaliser et d’étendre la surveillance génomique de la tuberculose.

[Narrateur] Pour commencer, prélevez un sédiment d’expectoration inactivé par la chaleur. Centrifuger l’échantillon à 16 800 G, ou à pleine vitesse pendant 15 minutes. À l’aide d’une pipette de 20 à 200 microlitres, aspirez doucement et jetez le surnageant, en veillant à ce que la pastille ne soit pas dérangée. Agitez doucement la suspension matricielle pour mélanger, puis pipetez 200 microlitres de la matrice bien mélangée pour remettre la pastille en suspension. Transférez tout le volume dans un tube à bouchon à vis de 1,5 millilitre contenant trois billes de verre pré-stérilisées de deux millimètres de diamètre. Maintenant, placez les échantillons dans un bloc chauffant à 56 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après l’incubation, homogénéisez les échantillons à l’aide d’un vortex pendant 10 secondes pour disperser les cellules, puis incubez les échantillons dans un bloc chauffant à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Homogénéisez les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur à grande vitesse avec un cycle de 60 secondes à 4,0 mètres par seconde. Ensuite, centrifugez la suspension à 12 000 G pendant cinq minutes. Transférez 130 microlitres de surnageant contenant de l’ADN dans un tube frais de 1,5 millilitre à faible liaison sans déranger la pastille. Jetez le premier tube contenant la matrice et les débris de la cellule. Pour purifier l’ADN à l’aide de billes magnétiques, vortex d’abord le flacon de stock de billes magnétiques ou l’aliquote préparée soigneusement pour remettre les billes en suspension avant utilisation, puis ajoutez 1,2 fois le volume de billes magnétiques à l’ADN extrait, pipetez la suspension 10 fois pour mélanger les échantillons avant de les incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Placez les échantillons sur un support magnétique à tube de 1,5 millilitre pendant trois minutes, ou jusqu’à ce que le liquide devienne clair, puis aspirez et jetez soigneusement le surnageant sans déranger les billes. Avec les tubes sur l’aimant, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 80 %, en veillant à ce que les billes ne soient pas dérangées. Après une incubation de 30 secondes, aspirez soigneusement et jetez l’éthanol sans déranger les billes. Après le deuxième lavage, retirez tout résidu d’éthanol à l’aide d’une pipette de 1 à 10 microlitres. Laissez les tubes ouverts pour sécher les billes à l’air libre pendant 10 minutes, ou jusqu’à ce qu’elles aient un aspect mat. Une fois que les billes ont un aspect mat, retirez les tubes de l’aimant et ajoutez 50 microlitres d’eau sans nucléase directement sur les billes de chaque échantillon. Ensuite, mélangez chaque échantillon individuel en pipetant 10 fois. Inspectez le tube pour voir s’il y a des perles coincées à l’intérieur. Après une incubation de cinq minutes à température ambiante, replacez les tubes sur la grille magnétique pendant trois minutes, ou jusqu’à ce que le liquide soit clair. Avec les tubes sur le support magnétique, transférez le surnageant contenant de l’ADN dans un tube stérile à faible liaison clairement identifié. La concentration d’ADN était plus élevée dans les échantillons de sédiments de deux millilitres, comparativement à 500 microlitres pour toutes les catégories de frottis. Une plus grande variabilité du rendement en ADN a été observée dans des échantillons de sédiments de 500 microlitres. La profondeur de couverture des lectures de séquençage était plus élevée dans les échantillons de sédiments de deux millilitres par rapport à 500 microlitres pour toutes les catégories de frottis. La variabilité était plus grande dans trois échantillons de plus de frottis extraits de sédiments de 500 microlitres. Les scores d’acceptabilité du séquençage étaient généralement plus élevés dans les échantillons de deux millilitres que dans les échantillons de 500 microlitres, avec une plus grande proportion de résultats hautement acceptables. Les échantillons de frottis de grade trois et plus présentaient la plus forte proportion de résultats acceptables, comparativement aux échantillons de frottis de grade un plus et deux plus. Les échantillons de 500 microlitres présentaient davantage de cas classés comme inacceptables ou non déterminés.