En face Cryosectionnement de la rétine de souris pour l’analyse moléculaire spatiale de haute dimension

La rétine est un modèle utile pour comprendre les calculs neuronaux. Ces calculs dépendent des positions spéciales des cellules. Cependant, il est resté difficile d’obtenir des cartes exhaustives à ce sujet.

Au cours de la dernière décennie, le séquençage de cellules uniques a fourni des descriptions claires des types de cellules rétiniennes. Aujourd’hui, la transcriptomique spatiale offre une nouvelle façon d’utiliser ces descriptions dans les tissus intacts. L’un des principaux défis de l’utilisation de la transcriptomique spatiale est qu’elle nécessite des coupes de tissu très minces. La rétine est déjà assez fine dans le plan horizontal qui nous intéresse.

En inventant cette méthode pour créer des sections fines et rapides, utiliser la transcriptomique spatiale dans l’apprentissage automatique pour cartographier toutes les cellules ganglionnaires rétiniennes d’un même tissu. Au cours des 30 dernières années, seules 17 cellules ganglionnaires rétiniennes sur 45 ont été cartographiées, et cette technique nous a permis de les cartographier toutes en même temps.

[Instructeur] Pour commencer, placez une souris euthanasiée sur la table de travail. Passage du pôle temporal du globe sur la cornée pour maintenir l’orientation et créer un point faible pour la dissection. Immergez le globe et visez la solution dans un plat contenant un morceau de papier filtre. À l’aide d’une pince pointue numéro cinq et de ciseaux à iris, retirez soigneusement toute la musculature, le fascia, le système vasculaire et les nerfs du globe sans perforer la sclère. Positionnez la pointe d’une lame de ciseau Iris perpendiculairement à la marque cornéenne. Percez le globe à cette position. Faites une seule incision nette à travers la cornée et le limbe, en continuant dans la sclérotique et la rétine vers la tête du nerf optique. Positionnez ensuite la lame perpendiculairement à la coupe initiale, à environ un millimètre en arrière du limbe. Commencez à couper radialement à travers la sclérotique et la rétine. Maintenez une ligne de coupe cohérente en arrière et parallèle au limbe en utilisant des pinces tranchantes pour guider et faire pivoter le globe. Si la rétine et la sclérotique se séparent, repositionnez la lame du ciseau de l’iris pour les couper ensemble. Estimez la distance postérieure d’un millimètre à l’aide de la largeur médiane de la lame de ciseaux de l’iris Après avoir terminé la coupe radiale parallèlement au limbe, vérifiez les connexions rétiniennes restantes. Coupez-les soigneusement avec des ciseaux à iris jusqu’à ce que les sections antérieure et postérieure du globe soient séparées. Ensuite, utilisez deux paires de pinces pointues numéro cinq pour séparer doucement les parties antérieure et postérieure du globe. Chez les souris plus âgées, si des fibres transparentes relient le cristallin à la cupule rétinienne, coupez-les soigneusement avec des ciseaux à iris tout en minimisant la séparation sclérale rétinienne. En utilisant le papier filtre comme plate-forme de support, coupez la rétine en une feuille de trèfle, également appelée motif en croix de fer avec des ciseaux à iris. Répétez la dissection avec le deuxième œil. Coupez l’extrémité d’une pipette de transfert en plastique jetable pour créer une ouverture plus grande que la rétine et la sclère disséquées. Aspirez doucement la rétine dans la pipette et déposez-la sur une lame de microscope en verre. À l’aide d’une lingette de laboratoire, retirez l’excès de solution de visée jusqu’à ce que la rétine ne flotte plus et puisse être aplatie. Utilisez maintenant deux pinces pointues numéro cinq pour déplier la rétine et la positionner à plat avec l’œilleton intérieur vers le haut. Faites des coupes en relief de 0,5 à deux millimètres de long dans chaque segment de relief de trèfle pour faciliter l’aplatissement et ajustez pour éviter le pliage. Retirez toute solution de visée restante, à l’exception du liquide adjacent à la rétine. À l’aide d’un couvercle, appuyez rapidement sur la rétine et transférez-la de manière à ce que la sclérotique externe soit tournée vers le haut et que l’œilleton intérieur soit en contact avec le couvercle. Vérifiez que la rétine n’est pas pliée et faites des ajustements si nécessaire. Ajoutez une solution de visée pour faciliter la manipulation, mais retirez l’excédent avec une lingette pour éviter le gondolement et laissez sécher à l’air libre pendant cinq à 10 secondes. Appliquez maintenant un milieu OCT pour couvrir la rétine. Ensuite, utilisez une pince pour répartir uniformément la couche sur la lamelle afin d’éviter la flottaison. Congelez instantanément la rétine en milieu OCT à l’aide d’une plaque métallique refroidie avec de la vapeur d’azote liquide, ou en contactant directement la glace sèche. Conservez la rétine congelée sur de la glace carbonique pour une utilisation immédiate. Pour la cryosection, créez un dôme OCT sur le mandrin de l’échantillon, occupant les deux ou trois anneaux intérieurs si vous utilisez le même modèle de cryostat. Alignez le mandrin de l’échantillon à plat sur la surface de coupe. Créez ou notez le guide d’orientation reliant le mandrin à l’étage du cryostat. Coupez ensuite le dôme pour former une surface plane parallèle à la lame. À l’aide d’une lame de rasoir, retirez l’excès d’OCT latéralement et séparez soigneusement la rétine de la lamelle pour la rendre mobile. Retirez le mandrin de la scène et appliquez une petite goutte de liquide OCT sur la surface plate OCT préparée. Ensuite, placez la rétine directement sur l’OCT liquide. Utilisez une lame en verre pré-refroidie pour appuyer et maintenir la rétine jusqu’à ce qu’elle soit congelée. Appliquez plus d’OCT sur la rétine et le mandrin pour assurer la liaison. Congelez ensuite l’ensemble dans la zone de congélation rapide du cryostat. Pour la section, coupez soigneusement l’excès d’OCT jusqu’à ce que la rétine soit visible. Utilisez une lame de rasoir pour façonner les bords du bloc OCT près de la rétine. Continuez à tailler tout en inspectant la présence de sclérotique. Lorsque la sclérotique est visible, ajustez l’angle de la scène au besoin. Arrêtez de tailler lorsque la sclérotique est à peu près uniformément répartie sur les sections. Maintenant, utilisez des diapositives pré-refroidies et deux pinceaux pour manipuler les sections et les collecter. Placez un doigt sous la section pendant environ cinq secondes jusqu’à ce que l’OCT fonde et adhère le tissu à la lame. Remettez ensuite la lame sur une surface froide pour la recongeler. Conservez les lames préparées sur de la glace carbonique pour une utilisation immédiate. L’immunoréactivité distincte ou RBPMS dans la couche de cellules ganglionnaires et la séparation claire du plexi vasculaire marqué par la lectine de la tomate ont confirmé la préservation réussie de la lamination rétinienne et des marqueurs protéiques. La détection multiplex de l’ARN à l’aide d’un panel 12-plex RNA Scope a réussi à maintenir la structure spatiale et à révéler l’expression distincte de marqueurs tels que Grm6 et RBPMS à travers la tranche sur face. Des images à haute résolution ont confirmé les modèles d’expression unicellulaire pour RBPMS et d’autres marqueurs tels que Mafb6 et Meis2, validant à la fois la localisation des protéines et de l’ARN dans la couche de cellules ganglionnaires. La distribution uniforme des signaux à travers les sections de feuilles de trèfle et les signaux forts dans les données transcriptomiques spatiales au xénium ont confirmé le profilage à haut débit et l’intégrité de l’ARN. Visualisation de la résolution d’une seule cellule à l’aide de modèles de détection manuelle appariés au xenium, confirmant la robustesse du protocole sur toutes les plateformes. Les marqueurs de transcription spécifiques au type cellulaire ont montré une distribution laminaire stratifiée en coupe efficace de la rétine et sur la cartographie faciale, préservé leur emplacement à travers les profondeurs. Un zoom détaillé sur la couche de cellules ganglionnaires a confirmé la détection précise de la transcription spatiale par rapport à la coloration nucléaire DAPI.