Imagerie haute résolution de C. elegans à tous les stades larvaires

Dans le laboratoire, nous travaillons sur toutes sortes de questions de biologie du développement. Moi-même, je travaille davantage sur le côté technique, en développant des méthodes pour mieux répondre à ces questions à l’aide de techniques d’imagerie. Le domaine de C. elegans a adopté avec succès une grande variété de méthodes, allant de l’édition de gènes CRISPR, de la transcriptomique et de la protéomique, jusqu’à la microscopie à super résolution. C. elegans est un modèle étonnant, cependant, dans le contexte de l’observation in vivo à haute résolution, il comporte ses défis, nécessitant une immobilisation pour une meilleure résolution, ce qui limite à son tour la viabilité animale. Le protocole présente une solution possible pour l’imagerie à long terme de C. elegans, permettant aux chercheurs d’adopter la méthode dans leur propre laboratoire et d’étudier une grande variété de processus de développement dynamiques directement in vivo. En laboratoire, la méthode a permis d’observer en détail la formation des organes, par exemple dans le contexte de la morphogenèse ou après les divisions cellulaires somatiques à l’âge adulte. La méthode a depuis été adoptée par de nombreux laboratoires étudiant un large éventail de processus de développement.

[Présentateur] Pour commencer, fixez l’appareil au cadre de support et montez-le sur le microscope droit. Remplissez une seringue d’eau déminéralisée, puis fixez une aiguille de calibre 23 et un long morceau de tube d’un pouce sur 16 pouces avec une goupille en acier creuse pliée. Remplissez le tube avec de l’eau déminéralisée de la seringue et insérez la goupille en acier dans le trou perforé de l’entrée de la vanne pour connecter le tube. Retirez la seringue et l’aiguille avant de fixer la tubulure au solénoïde hors puce. À l’aide du logiciel d’imagerie, allumez le solénoïde et mettez l’appareil sous pression pendant plusieurs minutes pour expulser tout l’air de la vanne. Vérifiez l’achèvement en vérifiant visuellement que l’interface air-eau apparaît sombre et disparaît dans le matériau PDMS. Éteignez le solénoïde à l’aide du logiciel d’imagerie. Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre avec la solution de bactéries filtrées et fixez une aiguille de calibre 30 et un long morceau de tube d’un pouce sur 32 pouces à l’aiguille. Appuyez sur le piston pour remplir l’aiguille et le tube attaché avec la solution bactérienne. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, insérez le tube d’un pouce sur 32 pouces directement dans l’entrée alimentaire du dispositif microfluidique et placez la seringue sur le pousse-seringue. Appuyez sur le piston de la seringue à l’aide de la vis à oreilles à l’arrière pour remplir l’appareil de liquide. Bloquez l’entrée et la sortie de la vis sans fin à l’aide de goupilles en acier scellées et appliquez une pression supplémentaire à l’aide de la vis de réglage pour éliminer tout air restant de l’appareil. Retirez ensuite la goupille en acier bloquée à la sortie et fixez le conteneur à déchets à la sortie. Poussez la seringue pour vous assurer que le conteneur à déchets est correctement connecté et qu’il n’y a pas de blocages dans le système. Retirez la deuxième goupille en acier bloquée de l’entrée et poussez la seringue jusqu’à ce qu’une petite goutte de liquide apparaisse à l’entrée de la vis sans fin. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 23, fixez un morceau plus long d’un tube d’un pouce sur 16 mesurant environ 15 à 20 centimètres à une seringue d’un millilitre remplie de tampon basal S. Fixez une goupille droite en acier de calibre 23 à l’autre extrémité du tube. Remplissez l’aiguille et la tubulure avec le tampon S-basal de la seringue. Maintenant, insérez la goupille en acier à l’extrémité du tube dans le tube contenant les vis sans fin et poussez une petite quantité de liquide à travers le tube pour vous assurer qu’il ne reste pas d’air. Tirez les vers dans le tube sans les tirer dans la seringue. Poussez ensuite la seringue connectée aux vers jusqu’à ce qu’une petite goutte de liquide apparaisse sur la goupille en acier et insérez la goupille en acier dans l’entrée de la vis sans fin du dispositif microfluidique. Placez l’appareil sur un microscope à faible grossissement, 5x ou 10x, ou sur un microscope de dissection. Positionnez l’appareil de manière à ce que l’entrée soit visible d’un côté du champ de vision et que l’arrière de l’entrée du canal de piège soit visible de l’autre côté. Poussez doucement sur le piston de la seringue à vis sans fin. Ensuite, poussez les animaux vers le réseau de canaux. Une fois qu’un animal fait face au canal, poussez-le dans le canal et répétez l’opération pour d’autres animaux. Après avoir piégé suffisamment d’animaux, placez la seringue, toujours attachée à l’entrée du ver, sur la platine du microscope où elle restera tout au long de l’expérience. Si le chargement a été effectué sur un microscope de dissection, transférez l’appareil sur le microscope imageur. Maintenant, allumez la pompe à seringue et faites-la fonctionner à un débit prédéfini d’un microlitre par heure pour 0,5 microlitre. Programmez la pompe à seringue de manière à ce qu’elle fonctionne à un microlitre par heure pour 0,5 microlitre, après quoi le débit est augmenté de 100 microlitres par heure pour 0,5 microlitre, et le modèle d’écoulement est répété tout au long de l’expérience. Placez l’appareil sur la platine du microscope et assurez-vous qu’il est fermement maintenu. Passez à l’agrandissement d’image souhaité. Identifiez les animaux et les régions d’intérêt dans le réseau de canaux de piège et configurez les conditions d’imagerie souhaitées. Image dans les conditions d’imagerie souhaitées, en actionnant la vanne sur puce à travers le solénoïde 10 secondes avant l’acquisition de l’image afin que les animaux soient maintenus en place. Le dispositif microfluidique a maintenu une qualité d’image élevée dans diverses modalités de microscopie, y compris les méthodes de fond clair, d’épifluorescence, de disque rotatif confocal et de super résolution grâce à l’utilisation d’un verre de couverture de 170 micromètres d’épaisseur. Développement des cellules épithéliales de Caenorhabditis elegans visualisé du début du stade larvaire L1 au stade larvaire moyen L2. L’induction des cellules précurseurs primaires de la vulve fanée et leurs divisions ultérieures de la fin du stade larvaire L1 au début du stade larvaire L4 étaient évidentes. Stades de formation de la vulve du début de la L3 à l’âge adulte. Les images acquises ont été améliorées grâce à la déconvolution et à l’enregistrement de l’image, améliorant ainsi la clarté visuelle. Les divisions cellulaires observées se sont produites de manière cohérente et opportune chez tous les animaux, toutes les divisions étant terminées pendant les durées typiques des stades larvaires. La longueur des gonades a augmenté régulièrement au cours des stades L2 et L3, avec des mesures cohérentes rendues possibles par l’orientation droite des animaux.