Amélioration de l’administration et de l’expression de gènes à l’aide de l’injection intraosseuse de plasmides d’éditeur de base d’adénine encapsulés dans des nanoparticules de chitosane

Nous proposons une méthode de thérapie génique qui délivre directement l’Editor Chitosan à base d’adénine à la moelle osseuse par injection intra-osseuse. L’efficacité de transfection des plasmides exogènes chez les animaux de laboratoire est relativement faible et l’introduction de plasmides pour l’expression génique à long terme peut être affectée par le système immunitaire. Nous utilisons le chitosane pour encapsuler les plasmides éditeurs à base d’adénine et délivrons directement le complexe dans la moelle osseuse de souris par injection intra-osseuse, ce qui le rend adapté aux maladies causées par une fonction anormale des ostéoclastes.

Notre protocole offre une efficacité de transfection élevée, de petits dommages biologiques et une efficacité d’expression génique élevée. Notre nouvelle stratégie est non seulement adaptée aux maladies causées par une fonction anormale des ostéoclastes, mais présente également un potentiel important pour faire progresser le domaine de la thérapie génique. Pour commencer, placez une souris euthanasiée sur une table de travail.

À l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler, retirez le tibia et enlevez tous les tissus musculaires environnants. Faites tremper le tibia nettoyé dans du PBS et lavez-le jusqu’à ce qu’il ne reste que l’os. Prélevez un millilitre de PBS dans une seringue et rincez les cellules de la moelle osseuse d’une extrémité du tibia jusqu’à ce que l’os devienne complètement blanc.

Ensuite, collectez la suspension cellulaire dans un tube. Centrifugez-le à 800 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir pipeté le surnageant, ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse des globules rouges à la cuillette.

Au bout d’une minute, ajoutez un millilitre de tampon de séparation pour terminer la lyse. Centrifugez à nouveau la suspension à 800 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et placez la pastille de cellule obtenue sur de la glace pour une utilisation ultérieure.

Pour la transfection du chitosane, dissoudre quatre milligrammes de chitosane dans 20 millilitres de solution d’acide acétique. Ajustez le pH à 5,5 à l’aide d’hydroxyde de sodium de 10 molaires. Ensuite, versez 500 microlitres de la solution de chitosane dans des microtubes à centrifuger individuels.

Ajoutez maintenant deux, trois, quatre et cinq microgrammes de plasmides ABE dans des tubes individuels. Dissoudre les plasmides dans 500 microlitres de sulfate de sodium de 30 millimolaires. Mélangez ensuite 500 microlitres de solution plasmidique avec 500 microlitres de solution de chitosane dans les tubes correspondants.

Incuber les tubes dans un bain-marie à 50 à 55 degrés Celsius pendant 15 minutes. Agitez chaque tube pendant 15 à 30 secondes et laissez-les reposer sans être dérangés pendant 30 minutes. Pour la caractérisation, analysez le diamètre et le potentiel zêta du chitosane à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière.

Maintenez la concentration de chitosane à 0,1 milligramme par millilitre dans de l’eau distillée deux fois. Ensuite, coulez 0,1 milligramme par millilitre d’échantillons de chitosane sur une puce de silicium. Ajoutez 20 microlitres d’échantillons remis en suspension sur 200 grilles de mailles et incuberez.

Centrifuger la suspension de cellules de moelle osseuse à 800 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le surnageant, puis ajoutez 500 microlitres de lysat de globules rouges. Au bout d’une minute, ajoutez un millilitre de tampon de séparation pour arrêter la réaction.

Comptez ensuite le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Ensuite, transférez 1 million de cellules dans un nouveau micro-tube de centrifugation. Après une nouvelle centrifugation, pipeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS.

Transférez les cellules remises en suspension dans un tube de cytométrie en flux et mesurez l’efficacité de la transfection à l’aide de la cytométrie en flux. Pour l’injection dans la cavité osseuse, fixez la souris anesthésiée en position couchée sur la table d’opération. Utilisez du ruban adhésif pour fixer le membre avant en place.

Désinfectez le tibia postérieur à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool. Chargez ensuite la solution plasmidique dans une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 26. Retirez toutes les bulles d’air et gardez la seringue prête pour l’injection.

Ensuite, touchez et stabilisez le tibia de la souris avec vos doigts. Positionnez l’aiguille d’injection pour qu’elle pénètre dans la diaphyse tibiale à partir du plateau tibial près de l’articulation du genou. Maintenant, tournez l’aiguille parallèlement au tibia, insérez-la dans la cavité de la moelle osseuse et injectez lentement pendant trois secondes.

Après l’injection, retirez lentement l’aiguille pendant trois secondes. Désinfectez immédiatement le site de ponction à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool pour arrêter tout saignement. Placez la souris dans un environnement chaud à 37 degrés Celsius pour faciliter sa récupération.

Les nanoparticules formées avec les plasmides ABE et GRNA avaient une morphologie sphérique uniforme et une distribution de taille étroite avec une taille moyenne de 202,9 nanomètres. Un potentiel zêta de 2,77 millivolts et un indice de polydispersité de 0,22. Le plasmide ABE intégré au chitosane a significativement amélioré le signal fluorescent dans les cellules de la moelle osseuse, indiquant une efficacité de transfection plus élevée par rapport au groupe témoin.

La cytométrie en flux a confirmé que le plasmide ABE codé au chitosane atteignait une efficacité de transfection élevée dans les cellules de la moelle osseuse. Avec une efficacité maximale de 51,2 %, observée à une dose de quatre microgrammes, tandis que trois microgrammes ont fourni un équilibre entre une efficacité élevée de 47,2 %, le séquençage de Sanger et la PCR de l’ADN génomique des cellules de la moelle osseuse ont révélé l’édition de gènes in vivo au site cible A1 avec une efficacité de 14,27 % et au site A2 avec une efficacité de 10,69 %.