Name: Développement d’une approche basée sur la microfluidique pour l’étude de la mécanique des polymères de microtubules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Découvrez une approche microfluidique pour étudier la mécanique des polymères de microtubules in vitro. Cette méthode résout les problèmes de bulles d'air et améliore les capacités de test à haut débit pour la recherche sur le cytosquelette.

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La microfluidique permet un contrôle précis de volumes de fluide minuscules, souvent inférieurs à un microlitre, grâce à la conception et à la fabrication complexes de canaux d’écoulement de fluide 1,2. La petite échelle des dispositifs microfluidiques donne lieu à des phénomènes d’ingénierie uniques. À savoir, le nombre de Reynolds - une mesure sans dimension du rapport entre les forces d’inertie et visqueuses dans l’écoulement des fluides - est petit, généralement de l’ordre de O(10) ou inférieur en microfluidique, soulignant l’importance des forces visqueuses dans les dispositifs microfluidiques. De plus, le nombre de Péclet, qui compare le transport convectif au transport diffusif, montre que le transport convectif est généralement négligeable en microfluidique 3,4,5. Ce régime d’écoulement laminaire piloté par diffusion en microfluidique est avantageux, car il prend en charge des expériences parallèles sur un seul appareil en maintenant des gradients de fluide précis.
La photolithographie reste la principale méthode de fabrication de dispositifs microfluidiques 6,7,8. En bref, ce processus implique la création d’un modèle gravé « maître » de la conception microfluidique (Figure 1). Un substrat photosensible est préparé et un photomasque de conception microfluidique expose sélectivement les zones de photorésine au rayonnement ultraviolet. Les méthodes de gravure ultérieures développent le substrat, produisant un relief du motif. Le polydiméthylsiloxane (PDMS) est souvent coulé et durci sur le maître. Le PDMS durci, qui adopte les caractéristiques négatives de la conception, est ensuite retiré du maître et collé à une lamelle de recouvrement en verre. L’ensemble de ce processus de fabrication prend généralement 1 à 2 jours, ce qui permet des itérations de conception rapides et la production de plusieurs appareils. Des revues détaillées des procédés de lithographie douce et de microfabrication sont disponibles dans d’autres références 1,2,3,10,11,12,13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig01.jpg"> 
Figure 1 : Aperçus du processus traditionnel de photolithographie et du processus de microfabrication. (A) Procédé de photolithographie traditionnel et (B) Processus de microfabrication. En fonction de l’application et des caractéristiques de photorésine souhaitées, une résine photosensible négative ou positive peut être utilisée, même si elles donnent le même maître de conception. Des caractéristiques telles que la hauteur souhaitée ou la température de fusion de la résine photosensible aident à déterminer le type de résine photosensible approprié. Cette figure a été modifiée avec la permission de Rogers (2022)14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
L’utilisation de la microfluidique a élargi les possibilités dans de nombreux domaines de recherche, son impact le plus récent étant dans les sciences biologiques. Compte tenu de sa petite échelle, la microfluidique permet de gérer avec précision des ressources limitées et précieuses telles que les cellules ou les protéines. Encore plus percutante est la capacité des systèmes microfluidiques à imiter les conditions physiologiques, telles que les modifications de la rigidité du substrat, l’exercice d’une force sur un échantillon et même l’intégration d’un courant électrique. De plus, l’utilisation de la microfluidique offre la possibilité de manipuler plusieurs réactifs en parallèle et de prototyper rapidement et d’affiner de manière itérative la conception des systèmes. Ces fonctionnalités permettent de miniaturiser l’ensemble des flux de travail du laboratoire sur un seul appareil, communément appelé « lab-on-a-chip »1,6,9,15,16,17,18,19.
L’une des applications de la microfluidique en biologie cellulaire est l’étude des polymères de microtubules. Les microtubules sont un composant essentiel du cytosquelette de la cellule, jouant un rôle essentiel dans des processus tels que la division cellulaire et le transport de marchandises intracellulaires20,21. En tant qu’élément le plus rigide du cytosquelette, les microtubules présentent un module d’élasticité comparable à celui du plexiglas22,23. Leurs propriétés mécaniques robustes sont cruciales pour diverses fonctions cellulaires, y compris, par exemple, la contraction des cardiomyocytes, où ils se plient et se détendent cycliquement pendant les phases systolique et diastolique24 du cœur. Des dispositifs microfluidiques ont déjà été adoptés pour étudier les propriétés des microtubules et de leurs structures d’ordre supérieur in vitro. En effet, la microfluidique a été utilisée pour sonder la dynamique de polymérisation des microtubules, les interactions microtubules-microtubules et les effets des protéines associées aux microtubules sur les propriétés mécaniques des microtubules 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41.
Bien que l’introduction de la microfluidique dans le domaine des microtubules ait donné lieu à de nombreuses découvertes passionnantes, l’adaptation de ces dispositifs à la recherche sur les microtubules peut encore être améliorée. Dans ce travail, nous abordons deux limites spécifiques qui persistent dans l’étude des microtubules dans les dispositifs microfluidiques : le potentiel de formation de bulles d’air à l’intérieur du dispositif, généralement introduit par la manipulation manuelle des dispositifs microfluidiques, et la sous-utilisation des tests à haut débit. Tout d’abord, les manipulations manuelles, telles que le bouchage et le débouchage des tubes, peuvent introduire la formation de bulles dans les canaux. La formation de bulles d’air à l’intérieur d’une cellule d’écoulement est catastrophique, car les bulles d’air peuvent dénaturer les protéines, cisailler les polymères de microtubules et nuire aux cultures cellulaires42,43. De plus, les angles vifs et les angles obliques de l’appareil entraînent un mouillage non uniforme de la surface, ce qui augmente la possibilité d’entraînement d’air. De nombreuses techniques ont été développées pour réduire la formation, la persistance et l’impact des bulles d’air ; Cependant, l’utilisation de méthodes d’atténuation des bulles n’est pas universelle 42,43,44,45,46. De plus, bien que l’un des principaux avantages de l’utilisation de la microfluidique soit la capacité d’expérimentation à haut débit, la microfluidique n’a pas encore été utilisée pour intensifier la recherche sur les microtubules. Les dispositifs microfluidiques peuvent être conçus pour tester plusieurs conditions expérimentales en parallèle sur le même appareil. Par exemple, les gradients de fluide peuvent être utilisés pour diriger le flux de différentes protéines ou médicaments associés aux microtubules, ce qui permet leur administration ciblée vers des régions spécifiques de microtubules cloisonnés au sein du même dispositif.
Ici, nous avons conçu de manière itérative un dispositif microfluidique qui répond à ces limitations. Nous fournissons le protocole étape par étape de la fabrication du dispositif, permettant ainsi à un public plus large d’utiliser la technologie microfluidique dans leurs recherches sur les microtubules. Cette conception de l’appareil intègre des fonctions de piégeage des bulles et utilise un système de contrôle de flux automatisé pour réduire les interventions manuelles tout en permettant des gradients de solutions dans l’appareil pour des analyses à haut débit. En résumé, le développement de cette conception microfluidique peut faciliter la recherche et la compréhension plus larges de la mécanique des microtubules tout en apportant des améliorations précieuses aux conceptions expérimentales dans le domaine plus large de la recherche sur les microtubules.

<table><tbody><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 0,6 mL (transparent)</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td> Le <td>type à faible rétention est préféré</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (transparent)</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td> Le <td>type à faible rétention est préféré</td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie standard de 1,5 mm</td><td>Integra LifeSciences</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>Ouverture numérique 100x/1,49 Objectif TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm verre lamelles de protection</td><td>ThorLabs</td><td>CG15CH</td><td></td></tr><tr><td>3 » plaquettes de silicium poli simple face</td><td>Plaquette universitaire</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>4 » Boîte de Pétri</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 &micro ; L, tube ultra-transparent à paroi mince à toit ouvert</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>345843</td><td>Appelé « tube airfuge » dans le protocole</td></tr> des <tr><td>lasers</td><td></td><td></td><td></td>à semi-conducteurs 488, 561 et 640 nm</tr> Nikon <tr><td>A-95 Rotor à angle fixe</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>347595</tr><tr><td>Acétone</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airfuge Air-Driven Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347854</td><td>Désigné sous le nom d''airfuge' dans le protocole</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Microscale Protein Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon Ultra EM-CCD</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor NEO sCMOS</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Versions génériques peut être utilisé</td></tr><tr><td>Cerveau bovin non étiqueté tubuline (purifiée)</td><td>N/A</td><td></td><td>Fabriqué en interne, mais peut être acheté</td></tr><tr><td>Caséine</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>MilliporeSigma</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Air propre et sec (CDA) (gaz sous pression)</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentation en air comprimé</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Se connecte à la microfluidique régulateur de débit</td></tr><tr><td>COMSOL Logiciel multiphysique</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de platine en laiton personnalisé</td><td>N/A</td><td></td><td>Fabriqué en interne pour s’adapter à nos lamelles de recouvrement de 22 mm x 22 mm sur le microscope</td></tr><tr><td>Eau désionisée N’importe</td><td>quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dessicator</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>logiciel Elveflow Smart Interface (ESI)</td> Raccords PFA sans bride <td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>avec ETFE &frac14 ; « -28 à 1/16 » Diamètre extérieur des embouts&nbsp ;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-XP-245X</td><td>Utilisé pour connecter le tube des flacons sources micrewtube au capteur de débit via le support de réservoir pressurisé</td></tr><tr><td>Fluiwell 4 canaux 2 mL Low Pressure</td><td>Fluigent</td><td>14002001</td><td>Utilisé pour connecter le système de contrôle de débit aux micrewtubes. Également appelé « rack de réservoir pressurisé »</td></tr><tr><td>Hotte</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine triphosphate (GTP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-625 haute vitesse roue à filtres</td><td>d’émission Finger Lakes Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td> en libre accès <td>Toute marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>Toute marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karl Suss MA-6 aligneur de masque</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de magnésium MilliporeSigma</td><td>1.05833</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAPOSIT SPR 220 7.0 photoresist</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raccords microfluidiques 6-40 à 1/4"-28 Kit d’adaptateurs</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-08</td><td>Utilisé pour connecter le tube des flacons sources micrewtube au capteur de débit via le support de réservoir sous pression (rack Fluiwell)</td></tr><tr><td>Raccords microfluidiques Kit d’adaptateur Luer Lock femelle</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-04</td><td>Utilisé pour connecter la seringue au tube</td></tr><tr><td>Régulateur</td> <td>de débit microfluidiqueElveflow</td><td>OB1 MK3+</td><td></td></tr><tr><td>Capteur de débit microfluidique</td><td>Elveflow</td><td>MFS3</td><td>Cette plage de capteur de débit est de 0 à 80 &mu ; L&nbsp ;</td></tr><tr><td>Développeur MICROPOSIT MF-319</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements logiciel</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azote (gaz sous pression)</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chauffage d’objectif</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One-Piece Fingertight 10-32 Raccord conique pour tube 1/16" OD&nbsp ;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-F-120X</td><td>Utilisé pour connecter la seringue à la tubulure</td></tr><tr><td>Paclitaxol (Taxol)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1097</td><td></td></tr><tr><td>Masques de photolithographie</td><td>N/A</td><td></td><td>Fabriqué par une partie externe à l’aide de nos conceptions</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Système de débitmètre plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-FMG</td><td>S’intègre au nettoyeur de plasma pour permettre le contrôle du débit de gaz sous pression</td></tr><tr><td>Pipette à bulbe en plastique</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic F-127</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2443</td><td>Désigné comme 'poloxomer 407' dans le protocole</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Research Products International</td><td>P41000</td><td></td></tr><tr><td>Saint Gobain Performance Plastics&nbsp ; Tube Tygon .020 ID</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-206-8921</td><td>Désigné comme « tube de 1,5 mm » et « tube » dans le protocole</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Toute marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Cost Effective Equipment, LLC.</td><td>200x</td><td>Ce modèle peut être abandonné</td></tr><tr><td>Pipettes et ensembles d’embouts standard</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue en plastique standard</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Nous avons utilisé une seringue Luer-slip de 10 ml</td></tr><tr><td>Kit d’élastomère de silicone Sylgard 184</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td>Désigné sous le nom de 'PDMS' et 'agent de durcissement' dans le protocole</td></tr><tr><td>T339 Micrewtube avec joint à lèvre et bouchon à vis plat</td><td>Medline Industried, LP.</td><td>T339</td><td>Désigné comme « flacon source » dans le protocole. Nous avons utilisé des formats de 0,5 mL et de 1,5 mL</td></tr><tr><td>TAMRA, SE ; 5-(et-6)-Carboxytétraméthylrhodamine, Ester succinimidylique</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td>Désigné sous le nom de 'TTR' dans le protocole</td></tr><tr><td>Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane</td><td>MilliporeSigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Trion Phantom RIE ICP&nbsp ;</td><td>Trion Technology, Inc.</td><td></td><td>Ce nettoyeur plasma n’est utilisé qu’à l’étape 1.1 du protocole. Un autre nettoyant plasma, comme celui utilisé pour le collage PDMS, peut être utilisé à la place ; nous préférons simplement le vide beaucoup plus faible réalisable par ce système pour le nettoyage de la plaquette de silicium</td></tr><tr><td>TRITC Anticorps polyclonal Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A6397</td><td>Appelé « anticorps anti-rhodamine » dans le protocole Pince à</td></tr><tr><td>épiler</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

développement d’une approche basée sur la microfluidique pour l’étude de la mécanique des polymères de microtubules

Development of a Microfluidics-Based Approach for Investigating Microtubule Polymer Mechanics

Développement d’une approche basée sur la microfluidique pour l’étude de la mécanique des polymères de microtubules

In this protocol, we describe the design and fabrication of a microfluidic device developed for the investigation of microtubule polymer mechanics. The ...

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Nous présentons une procédure pour former un poly (éthylène glycol) monocouche auto-assemblées (PEG-SAM) sur un substrat de silicium avec des microélectrodes d'or. Le PEG-SAM est formé en une seule étape et prévient l'encrassement biologique sur des surfaces de silicium et de l'or. L'électrophorèse est ensuite utilisé pour des biomolécules patterning jusqu'à l'échelle nanométrique.

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