Développement d’une approche basée sur la microfluidique pour l’étude de la mécanique des polymères de microtubules

Les microtubules sont des polymères cytosquelettiques qui jouent un rôle essentiel dans la division cellulaire et le transport intracellulaire. Dans cette étude, nous adoptons la microfluidique pour étudier la mécanique des microtubules in vitro. Ce travail aborde deux limites spécifiques à l’étude des microtubules dans les dispositifs microfluidiques, le potentiel de bulles d’air, qui peuvent dénaturer les protéines, et le manque d’utilisation de tests à haut débit. Notre dispositif microfluidique et notre protocole permettent une gamme de configurations expérimentales avec des capacités de test à haut débit plus robustes que nos précédents tests de cellules d’écoulement.

[Instructeur] Pour commencer, nettoyez au plasma une plaquette de silicium de trois pouces sous vide pendant cinq minutes en utilisant de l’oxygène ou du plasma à air propre et sec. Assurez-vous que la pression de vide est inférieure à cinq fois dix à la puissance moins cinq torr. Centrez la plaquette de silicium propre sur le codeur de spin pour le dépôt de photorésine et déposez un à deux millilitres de résine photosensible SPR 227.0 au centre de la plaquette de silicium. Appliquez une couche de résine photosensible pour obtenir une couche de 13 micromètres d’épaisseur à 1000 tours par minute pendant 30 secondes. Tout en minimisant le contact avec la surface revêtue, transférez la plaquette de silicium sur une plaque chauffante réglée à 70 degrés Celsius. Incuber la plaquette de silicium sur la plaque chauffante, en augmentant la température de 10 degrés Celsius toutes les trois à cinq minutes jusqu’à ce que la température atteigne 115 degrés Celsius. Éteignez ensuite la plaque chauffante et laissez la plaquette de silicium refroidir jusqu’à ce que sa température soit inférieure à 65 degrés Celsius. À l’aide d’une pince, transférez la plaquette refroidie dans l’aligneur de masque. Chargez à la fois la plaquette de silicium et le masque photo approprié dans l’aligneur conformément aux protocoles spécifiques du fabricant ou du site, exposez maintenant la plaquette à un rayonnement ultraviolet avec une énergie d’environ 400 millijoules par centimètre carré. Calculez le temps d’exposition requis à l’aide de la formule. Après la réhydratation et le traitement thermique, immergez la plaquette dans le révélateur approprié. Rincez ensuite doucement les deux côtés de la gaufrette avec de l’eau déminéralisée pendant 30 secondes. Après avoir séché la plaquette développée à l’aide d’azote gazeux, transférez-la dans un dessiccateur. Placez un petit récipient en aluminium dans le dessiccateur et ajoutez une goutte de silane dans le récipient en aluminium. Après la dessiccation, versez le polydiméthylsiloxane mélangé et dégazé sur le moule maître à l’intérieur d’une boîte de Pétri. Incuber la parabole à 65 degrés Celsius pendant la nuit pour permettre au PDMS de durcir complètement. Autour des caractéristiques de l’appareil, utilisez un scalpel ou une lame de rasoir pour découper des morceaux rectangulaires de PDMS dans la couche principale. Assurez-vous que chaque pièce comprend un espace de flanquement adéquat pour permettre un bon contact de liaison et s’adapte à une lamelle en verre de 22 x 22 millimètres. Placez le PDMS sur une couche PDMS sacrificielle de rechange, en évitant les surfaces dures. Ensuite, à l’aide d’un poinçon propre de 1,5 millimètre, faites des trous d’entrée et de sortie dans chaque pièce PDMS. Maintenant, récupérez une lamelle en verre de 22 x 22 millimètres et nettoyez-la à l’aide d’une lingette imbibée d’alcool isopropylique. Ensuite, nettoyez au plasma la lame de couvercle en verre sous vide pendant cinq minutes à l’aide d’un plasma d’air propre et sec. Essuyez à la fois la lamelle en verre et le côté caractéristique du PDMS avec des lingettes imprégnées d’alcool isopropylique avant de les placer dans le nettoyeur plasma et nettoyez-les simultanément au plasma pendant 30 secondes sous vide à l’aide d’un plasma d’air propre et sec. Après le nettoyage, retournez le PDMS de manière à ce que son côté caractéristique soit orienté vers le bas. Placez le PDMS sur la lamelle en verre et appuyez légèrement pour favoriser l’adhérence. Les extensions de microtubules stabilisées ont été pliées par une solution tampon perpendiculaire à leur direction de croissance, démontrant la capacité d’appliquer une force directionnelle à l’intérieur du dispositif. La vitesse d’écoulement près de la surface ressentie par les microtubules a été calculée à 92 micromètres par seconde à l’aide d’une simulation et d’une modélisation analytique basée sur l’équation de Navier-Stokes. Des simulations informatiques ont démontré l’établissement de gradients stables à travers le dispositif, confirmés expérimentalement par un colorant fluorescent montrant des modèles de concentration prévisibles. Extensions de microtubules à double marquage, partitionnement confirmé basé sur le gradient avec différentes protéines fluorescentes dominant dans des zones spatiales distinctes le long du dispositif.