Test immunochimique validé pour la détermination complète du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain libéré et lié aux cellules

Nous présentons un sandwich validé, ELISA, utilisant de nouveaux anticorps monoclonaux, qui permet une quantification précise du domaine extracellulaire lié et libéré de la protéine HER2 pour des cellules cultivées in vitro et des échantillons de patients.

Le protocole répond à la nécessité de disposer d’un test précis et validé pour corréler la concentration de la protéine HER2 circulante avec les manifestations cliniques de la maladie dans le diagnostic et la recherche.

La large gamme de fonctionnement du test, la variété des types d’échantillons et la fiabilité des résultats pourraient ouvrir de nouvelles possibilités pour une analyse complète de l’état des récepteurs dans des modèles in vitro et in vivo.

L’ELISA mis au point sera utilisé pour quantifier les HER2 libérés par les tissus cancéreux dans différentes excrétions du corps humain comme le sang, les fluides péritonéaux ou le mucus.

[Instructeur] Pour commencer, détachez les cellules à l’aide de trypsine après qu’elles aient atteint 80 % de confluence et rassemblez-les dans un tube conique séparé de 15 millilitres. Après avoir compté les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatique et ensemencer trois fois 10 à la puissance cinq cellules par puits dans une plaque de 12 puits avec un millilitre de milieu de croissance. Incuber la culture à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone. À partir de la culture de 24 heures, prélevez le milieu de culture d’un puits de chaque lignée cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifuger les échantillons prélevés à 10 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et transférer le surnageant dans un nouveau tube pour le stocker à moins 20 degrés Celsius. Lavez les cellules restantes dans chaque puits avec un millilitre de PBS froid, aspirez doucement et jetez le PBS. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon RIPA, complété par un inhibiteur de protéase à 1 % dans chaque puits et incubez pendant cinq minutes. Maintenant, grattez les cellules avec un grattoir cellulaire et mélangez le lysat en pipetant plusieurs fois pour homogénéiser. Collectez les cellules lysées dans un nouveau tube et aspirez lentement l’échantillon dans une seringue de deux millilitres équipée d’une aiguille de calibre 21 mesurant 0,8 par 40 millimètres. Après avoir aspiré cinq à dix fois, centrifuger les échantillons collectés à 10 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et transférer le surnageant dans un nouveau tube pour le stocker à moins 20 degrés Celsius. Diluez l’anticorps capteur Anti-HER2 à un microgramme par millilitre dans un tampon codant. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de la solution d’anticorps de capture dans chaque puits d’une plaque ELISA de 96 puits. Recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité. Incuber l’assiette toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après une nuit d’incubation, placez la plaque à température ambiante sur un agitateur horizontal à microplaques pendant une heure. À l’aide d’un laveur de microplaques, aspirez la solution d’enrobage et lavez chaque puits trois fois avec 300 microlitres de PBST. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage contenant 5 % de lait écrémé en poudre dans du PBS dans chaque puits enrobé pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Maintenant, préparez la courbe d’étalonnage et le contrôle positif. Ajoutez deux microlitres d’un milligramme par millilitre, solution mère HER2 à 1 998 microlitres de PBS pour créer un standard de travail de 1000 nanogrammes par millilitre. Pour la deuxième norme, ajoutez 500 microlitres de la norme 1 à 500 microlitres de PBS et mélangez soigneusement pour obtenir une concentration de 50 nanogrammes par millilitre. Préparer la dilution en série pour générer les étalons trois à sept. Ensuite, préparez des échantillons matriciels à l’aide de lysats cellulaires PBS et d’un milieu de culture enrichi avec des concentrations HER2 connues. Diluez les lysats cellulaires de un à 2000 avec 2,5 microlitres de lysat et cinq millilitres de PBS pour obtenir des niveaux de HER2 inférieurs à la limite de détection. Pour préparer une solution de deux nanogrammes par millilitre, ajoutez huit microlitres de 1 standard à 392 microlitres de milieu de culture PBS ou de lysat cellulaire et mélangez soigneusement. À l’aide d’une pipette monocanal, ajoutez 100 microlitres d’échantillons blancs et d’échantillons de test PBS étalons en trois exemplaires dans leurs puits respectifs de la plaque ELISA revêtue et bloquée. Après une heure à 37 degrés Celsius dans une chambre d’humidité, lavez la plaque à l’aide d’une rondelle de microplaques. Pour détecter la liaison des anticorps, diluez l’anticorps de détection biotinylé dans le PBS à une concentration de travail d’un microgramme par millilitre. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de cette solution d’anticorps de détection dans chaque puits. Ensuite, diluez l’AVID et le HRP conjugués à 40 000 dans 40 millilitres de PBST. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de conjugué dilué dans chaque puits. Après l’incubation et le lavage de la plaque, utilisez une pipette multicanaux pour ajouter 100 microlitres de substrat de 3,3 5,5 tétraméthylbenzidine dans chaque puits pour initier la réaction métrique de couleur. Ensuite, recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une à cinq minutes, en la protégeant de la lumière tout en surveillant le développement des couleurs. Lorsque l’intensité de couleur souhaitée est atteinte, ajoutez 100 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits pour terminer la réaction. Enfin, mesurez l’absorbance à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques. À l’aide d’une courbe d’étalonnage à quatre paramètres, calculez la concentration de l’échantillon en fonction de l’équation de la courbe. Le sandwich développé, ELISA, a démontré une plage de fonctionnement pour la protéine HER2 de 1,56 à 100 nanogrammes par millilitre avec un coefficient de détermination de un indiquant une excellente correspondance. La concentration de HER2 dans le milieu de culture a augmenté au fil du temps pour toutes les lignées cellulaires testées avec les valeurs les plus élevées à 72 heures. Les cellules SK-OV-3 et SK-BR-3 ont montré des concentrations de HER2 environ dix fois et 50 fois plus élevées, respectivement, par rapport aux cellules MDA-MB-231 dans le milieu de culture à 24 heures. De même, les niveaux de HER2 dans les lysats étaient environ trois fois et cinq fois plus élevés pour SK-OV-3 et SK-BR-3, respectivement. Il est intéressant de noter que le milieu de culture cellulaire contenait des concentrations 1000 fois plus faibles de l’antigène testé par rapport à la protéine liée à la membrane trouvée dans les lysats de cellules entières.