Name: Génération de cultures monoclonales à partir de la lignée cellulaire de Drosophila melanogaster JW18 infectée par Wolbachia (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Découvrez la génération de lignées cellulaires monoclonales JW18 pour étudier les phénotypes de Wolbachia dans Drosophila melanogaster. Cette méthode réduit la variabilité expérimentale et améliore la reproductibilité des cultures cellulaires d'insectes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; m seringue fliter&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Le</td><td>99722</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Verre de protection rond de 12 ou 18 mm&nbsp ;</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes Falcon de 15 mL</td><td>Génoplaste</td><td>601052</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Plaque à 24 puits</td><td>CytoOne</td><td>Référence CC7682-7524</td><td>Culture tissulaire traitée</td></tr><tr><td>5 et micro ; Filtre à seringue M</td><td>Whatman</td><td>10462000</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>CytoOne</td><td>Référence CC7682-7506</td><td>Culture tissulaire traitée</td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>CytoOne</td><td>Référence CC7682-7596</td><td>Culture tissulaire traitée</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J66501.30</td><td></td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire, 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one</td><td>391-3103</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Racleurs de cellules&nbsp ;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>391-3010</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Vernis à ongles transparent&nbsp ;</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacons CryoPure</td><td>Sarstedt</td><td>72.379</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>DMSO, qualité culture cellulaire</td><td>Merck</td><td>D2650-100ML</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>DreamTaq PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>Référence 324503-100GM</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Alimentation par électrophorèse</td><td>Merck</td><td>PS 251-2</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp ; Concentrateur Plus</td><td>Merck</td><td>EP5305000509</td><td>Un concentrateur d’aspirateur de n’importe quelle marque peut être utilisé à la place.</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Merck</td><td>1009861000</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie EVOS M5000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>Un microscope inversé de n’importe quelle marque peut être utilisé pour surveiller la progression des clones. Un microscope fluorescent est nécessaire pour visualiser les POISSONS.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td>Inactivé par la chaleur</td></tr><tr><td>Formaldéhyde&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>047377.9L</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>F7503-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Cuves d’électrophorèse sur gel</td><td>Cleaver Scientific</td><td>MSMIDI</td><td></td></tr><tr><td>Imageur Gel</td><td>BioRad</td><td>12009077</td><td>Système d’imagerie GelDoc Go Gel</td></tr><tr><td>Échelle d’ADN GeneRuler 100 bp</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Référence SM0243</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88870005</td><td></td></tr><tr><td>Herasafe 2025 Enceinte de sécurité biologique de classe II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51033314</td><td>L’enceinte de sécurité biologique de n’importe quelle marque peut être utilisée tant qu’elle maintient un environnement stérile à l’intérieur.</td></tr><tr><td>Solution Hoechst 33342 (20 mM) 5 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62249</td><td>Stocker dans l’obscurité.</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Merck</td><td>258148-2,5 L</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp. PIPETBOY acu 2 Aide à la pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085686</td><td>Un contrôleur de pipette sérologique de n’importe quelle marque peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>I9516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur de laboratoire</td><td>&nbsp ; Liebherr&nbsp ;</td><td>LGUex 1500 MediLine</td><td>Tout congélateur capable de maintenir une température constante convient.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Réservoir d’azote liquide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>CY50985</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Merck</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité moléculaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanaux</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Nanogoutte</td><td>Peqlab</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre Neubauer</td><td>Merck</td><td>BR717810-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp ; M Film d’étanchéité</td><td>Merck</td><td>HS234526B-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur refroidi par Peltier</td><td>Memmert</td><td>IPP55plus</td><td>Y a-t-il un incubateur capable de maintenir une constante de 25 ? C convient. Aucun contrôle CO2 n’est requis pour la lignée cellulaire JW18 ou ses clones.</td></tr><tr><td>Phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>327115000</td><td></td></tr><tr><td>Set de pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>EP2231300008</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de potassium</td><td>Merck</td><td>P1190-500G</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Quasar&nbsp ; Sonde FISH à ARNr 16s marquée 670&nbsp ; poser</td><td>Technologies de biorecherche</td><td></td><td>Sur mesure, les séquences des sondes se trouvent dans le tableau 1.</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse réfrigérée</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>rpl32 amorce avant 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATC-3'</td><td>Génomique Eurofins</td><td></td><td>Fabriqué sur mesure sur la base de la référence citée dans l’article</td></tr><tr><td>rpl32 amorce inversée 5'-CAATCTCCTTGCGCTTCTTG-3'</td><td>Génomique Eurofins</td><td></td><td>Fabriqué sur mesure sur la base de la référence citée dans l’article</td></tr><tr><td>SDS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Référence AM9823</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques</td><td>Corning</td><td>357771</td><td></td></tr><tr><td>Boucliers et Sang M3 Insecte Medium</td><td>Merck</td><td>S8398</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Tampon d’hybridation Stellaris RNA FISH&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Technologies de biorecherche</td><td>Référence SMF-HB1-10</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH Tampon de lavage A&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Technologies de biorecherche</td><td>Référence SMF-WA1-60</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH Tampon de lavage B&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Technologies de biorecherche</td><td>SMF-WB1-20</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Réservoirs de réactifs stériles&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8094</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Tampon TAE</td><td>Merck</td><td>1061741000</td><td>1x&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tampon TE&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>93283</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Syngen Biotech</td><td>Bloc thermique 96</td><td>Un thermocycleur de n’importe quelle marque peut être utilisé à la place.</td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td>Stérile</td></tr><tr><td>Congélateur ultra basse température</td><td>Société PHC&nbsp ;</td><td>MDF-DU502VH-PE</td><td>Y a-t-il un congélateur de laboratoire capable de maintenir -80 °C ? C peut être utilisé.</td></tr><tr><td>Support de montage Vectashield&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Laboratoires Vecteurs</td><td>N° H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>wsp apprêt avant 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3'</td><td>Génomique Eurofins</td><td></td><td>Fabriqué sur mesure sur la base de la référence citée dans l’article</td></tr><tr><td>wsp apprêt inverse 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3'</td><td>Génomique Eurofins</td><td></td><td>Fabriqué sur mesure sur la base de la référence citée dans l’article</td></tr></tbody></table>

génération de cultures monoclonales à partir de la lignée cellulaire de drosophila melanogaster jw18 infectée par wolbachia

Generation of Monoclonal Cultures from Wolbachia-infected Drosophila melanogaster JW18 Cell Line

Nous avons visualisé le processus d’établissement de cultures monoclonales par microscopie optique, depuis le jour de la préparation de la suspension unicellulaire et du placage (jour 0) jusqu’à l’établissement de lignées cellulaires continues (jour 45 ou 77, Figure 2). Les premiers signes de division cellulaire ont été observés le jour 3 (4 jours après le placage, car le placage a été effectué le jour 0) alors qu’il y avait déjà quatre cellules par puits (Figure 2). Le 14e jour, les clones se sont développés soit sous la forme d’une monocouche (JW18-B9, C7 et E5), soit sous la forme d’une sphère (JW18-G4), qui a été perturbée pendant le passage. Au 28e jour, les différences de croissance entre les lignées cellulaires étaient les plus évidentes. La culture JW18-C7 était confluente au jour 45, tandis que les cultures clonales restantes n’étaient établies qu’au jour 77. Nous avons également visualisé les quatre cultures différentes 30 passages après l’établissement pour capturer les différences de morphologies cellulaires (Figure 3).
Pour déterminer le statut d’infection à Wolbachia des cultures monoclonales, nous avons effectué une PCR (Figure 4) et une FISH (Figure 5). Nous avons observé que tous les clones sauf un (JW18-C7) produisaient une bande pour le gène wsp , indiquant une infection à Wolbachia . L’étude FISH a corroboré les résultats de la PCR : les clones JW18-B9, JW18-E5 et JW18-G4 ont conservé l’infection à Wolbachia , tandis que le clone JW18-C7 n’a pas été infecté par Wolbachia. Dans l’ensemble, à partir d’une population mixte de cellules JW18, nous avons pu établir quatre cultures clonales, dont trois ont conservé l’infection originale à Wolbachia . Les données brutes sont accessibles à l’adresse Figshare : https://figshare.com/s/15fde47ca7338f31dda9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig1.jpg"> 
Figure 1 : Flux de travail pour la génération de cultures monoclonales. (A) Dilutions primaires et secondaires dans la plaque à 96 puits. (B) Cellules uniques après dilution en série. (C-E) Progression de la multiplication des cellules et du transfert de la plaque de 96 puits à 24 et 6 puits, respectivement. (F) Cultures continues dans des flacons deculture de 25 cm à 2 cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig2.jpg"> 
Figure 2 : Progression des lignées clonales de JW18 de la culture unicellulaire à la culture multicellulaire. Images en fond clair de lignées clonales du jour 0 (jour du placage) au jour 77, lorsque toutes les lignées ont été établies avec succès dans un flacon de culture cellulaire de25 cm 2. Barres d’échelle = 25 μm (jour 0), 50 μm (jour 3), 150 μm (jour 14), 300 μm (jours 28, 45, 77). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig3.jpg"> 
Figure 3 : Morphologie des lignées clonales individuelles de JW18. Images en fond clair de lignées clonales montrant les morphologies cellulaires au passage 30 après l’établissement. Barres d’échelle = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig4.jpg"> 
Figure 4 : Statut de Wolbachia des cultures clonales examinées par PCR. PCR pour Wolbachia dans la lignée cellulaire parentale JW18 et les lignées clonales JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5 et JW18-G4 au passage 11 après l’établissement. La bande Wolbachiawsp confirme la présence de Wolbachia, tandis que la bande Drosophilarpl32 est une PCR de contrôle de la qualité de l’ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig5.jpg"> 
Figure 5 : Statut de Wolbachia des cultures clonales examinées par FISH. Lignée cellulaire parentale JW18 et clones JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5, JW18-G4 visualisés par coloration FISH au passage 13 après l’établissement. Wolbachia est coloré avec la sonde FISH Stellaris à ARNr 16s marquée Quasar 670 et définie en magenta, et les acides nucléiques sont colorés avec Hoechst 33342 en cyan. Barres d’échelle = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire S1 : Sondes oligonucléotidiques conçues contre l’ADNr de Wolbachia wMel 16S et leur comparaison avec les sondes publiées par Schneider et al.42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/Table%20S1.%20Stellaris%20probe%20set%20_16052025.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Génération de cultures monoclonales à partir de la lignée cellulaire de Drosophila melanogaster JW18 infectée par Wolbachia

Cell lines are widely used models in biological research. They are particularly useful in studies of intracellular bacteria that cannot be efficiently ...

generation-monoclonal-cultures-from-wolbachia-infected-drosophila

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hémocytes drosophile se dispersent sur ​​l'ensemble de l'embryon en développement. Ce protocole démontre comment monter et à l'image de ces migrations à partir d'embryons avec les hémocytes marqués par fluorescence.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

Nous fournissons un protocole détaillé pour la préparation de cellules primaires dissociées...

Cultures de cellules primaires à partir Drosophile Embryons Gastrula

Drosophila melanogaster est un organisme modèle exceptionnel pour l’étude du système immunitaire inné et des conséquences physiologiques des infections et des maladies. Ce protocole décrit comment administrer des infections bactériennes robustes et quantitativement reproductibles à D. melanogaster, et comment mesurer par la suite la gravité de l’infection et quantifier la réponse immunitaire de l’hôte.

Infection bactérienne systémique et défense immunitaire phénotypes<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Une méthode pour l' élevage Drosophila melanogaster dans des conditions axéniques et gnotobiotiques est présenté. Fly embryons sont dechorionated dans l'hypochlorite de sodium, transférés de manière aseptique à l'alimentation stérile, et élevés dans des récipients fermés. Inoculant régime alimentaire et les embryons avec des bactéries conduit à des associations gnotobiotiques, et la présence bactérienne est confirmée par plaquage du corps entier homogénats drosophile.

L&#39;élevage du Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sous axéniques et gnotobiotique Conditions

L’analyse de la relation structure-fonction mitochondriale est nécessaire pour une compréhension approfondie des mécanismes de régulation de la fonctionnalité mitochondriale. Des méthodes spécifiques pour étudier la structure et la fonction mitochondriales dans les ovaires de drosophile vivants et fixes sont décrites et démontrées dans cet article.

Étudier mitochondrial Structure et fonction Drosophila ovaires

Cette méthode montre comment visualiser invasion de pathogènes dans les cellules d’insectes avec des modèles tridimensionnels (3D). Hémocytes de larves de drosophile étaient infectées par des pathogènes virus ou bactériens, ex vivo ou in vivo. Hémocytes infectés ont été ensuite fixe et teintés d’imagerie avec un microscope confocal et la reconstruction cellulaire 3D ultérieure.

Extraction des hémocytes de larves de drosophile d’Infection microbienne et d’analyse

Ce protocole décrit comment établir une infection virale in vivo chez Drosophila melanogaster en utilisant la méthode de nano-injection et les techniques de base pour analyser l’interaction virus-hôte.

Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Lignées de cellules de drosophile sont importants réactifs pour la recherche fondamentale et recherche biomédicale. Cet article fournit des protocoles pour la décongélation, repiquage et la cryoconservation des lignées de cellules Drosophila couramment utilisées pour aider les chercheurs à intégrer l’emploi de ces réactifs dans leurs recherches.

Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

Les mouches adultes Drosophila melanogaster ont été largement utilisées comme organismes modèles pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux réponses immunitaires innées antimicrobiennes de l’hôte et les stratégies d’infection microbienne. Pour promouvoir le stade larvaire de D. melanogaster en tant que système modèle supplémentaire ou alternatif, une technique d’injection larvaire est décrite.

Drosophila melanogaster Protocole d’injection de larves

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

Imagerie en direct étendue des niches de cellules souches germinales de Drosophila melanogaster femelle

Découvrez la génération de lignées cellulaires monoclonales JW18 pour étudier les phénotypes de Wolbachia dans Drosophila melanogaster. Cette méthode réduit la variabilité expérimentale et améliore la reproductibilité des cultures cellulaires d'insectes.

Génération de cultures monoclonales à partir de la lignée cellulaire de Drosophila melanogaster JW18 infectée par Wolbachia

Explorer plus de vidéos