Modification enzymatique et évaluation par cytométrie en flux des protéines affichées à la surface de la levure

Cette recherche se concentre sur l’étude des modifications chimiques des protéines qui dictent le comportement des cellules. Dans ce cas, l’objectif est de comprendre les préférences et la cinétique des enzymes modifiant une variété de substrats.

La capacité de déphosphoryler une molécule de substrat affichée à la surface de la levure a été démontrée pour la première fois. Cette découverte ouvre des possibilités de cartographie cinétique généralisable des modifications enzymatiques qui n’étaient pas accessibles auparavant. Cette recherche aborde les défis associés à la compréhension des interactions entre les substrats enzymatiques. En règle générale, des lysats cellulaires ou des peptides personnalisés sont nécessaires pour ce type d’évaluation. Ici, une alternative FasL est fournie par l’utilisation de substrats exposés par la levure.

Ce protocole fait progresser l’affichage traditionnel de la surface de la levure vers l’analyse de ce qui serait normalement des réactions enzymatiques intracellulaires dans l’espace extracellulaire, permettant l’analyse FasL de ces interactions normalement difficiles à évaluer.

Ce protocole permet d’interroger les préférences de substrat d’une variété d’enzymes à l’aide de méthodes à haut débit et d’effectuer des études cinétiques avec une lecture simple.

[Instructeur] Pour commencer, décongelez une aliquote des cellules de levure préparées sur de la glace. Ajoutez 0,5 à 1,5 microgramme d’ADN plasmidique contenant la construction d’affichage de levure directement dans les cellules. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de la solution de transformation ou une solution stérile de polyéthylène glycol à 50 % et d’acétate de lithium à 0,1 molaire. Combinez soigneusement le mélange de cellules, d’ADN plasmidique et de solution de transformation par pipetage. Incuber le mélange de transformation de manière statique pendant 30 à 60 minutes à 30 degrés Celsius, et agiter le mélange à intervalles de 15 minutes. Récoltez les cellules par centrifugation à 1000G. Préparez un tube de culture de 14 millilitres avec 4,5 millilitres de milieu de croissance de cellules de levure contenant des plasmides, ou SDCAA. Remettez en suspension les cellules contenant le plasmide souhaité dans 500 microlitres de SDCAA et inoculez les 4,5 millilitres de milieu préparés. Répartissez soigneusement 50 microlitres des cinq millilitres de culture inoculée sur une plaque SDCAA sans percer la tarière. Incuber statiquement à 30 degrés Celsius pendant 48 heures pour déterminer l’efficacité de la transformation. Maintenant, incubez les cinq millilitres de culture cellulaire SDCAA dans un incubateur à secouer à 30 degrés Celsius et 300 tr/min pendant au moins 18 heures. Surveillez la densité optique à 600 nanomètres après 16 heures, et répétez l’opération après 20 heures. Une fois que l’échantillon atteint une densité optique ne dépassant pas six, centrifugez la culture pendant trois minutes à 2500G et jetez le surnageant sans perturber la pastille de levure. Remettez en suspension la pastille de levure dans l’induction de l’expression protéique, ou milieu SRGCAA, jusqu’à une densité optique finale de 600 nanomètres inférieure à un. Incuber la culture de levure dans un incubateur à agitation à 30 degrés Celsius et 300 tr/min pendant au moins huit heures, mais pas plus de 24 heures. Mesurez ensuite la densité optique à 600 nanomètres pour déterminer la densité cellulaire. Préparez le tampon de travail pour les échantillons en diluant la solution tampon de travail 2X dans un rapport de un à deux avec de l’eau désionisée dans un flacon de 1,7 millilitre. Ajoutez le volume approprié de culture de levure nécessaire pour récupérer deux millions de cellules de levure dans le flacon de 1,7 millilitre pour chaque échantillon. Centrifugez le flacon pendant une minute à 4500 G et, à l’aide d’une micro-pipette, retirez et jetez soigneusement le surnageant en tant que déchet biologique dangereux. Remettre en suspension les cellules granulées dans un millilitre de PBSA avant de répéter la centrifugation et l’élimination du surnageant. Gardez-le de côté. Préparez la solution humaine recombinante de SHP-2 à une concentration finale de 1 000 nanomoles dans un volume de réaction total de 20 microlitres. Ensuite, ajoutez 7,7 milligrammes de DTT dans 10 millilitres d’eau déminéralisée dans un tube conique de 15 millilitres pour créer une solution de DTT de cinq millimolaires. Maintenant, prenez les cellules granulées et mettez-les en suspension dans le tampon de travail de sorte que le volume de réaction final soit de 20 microlitres par échantillon. Ajoutez deux microlitres de la solution de DTT à cinq millimolaires à chaque échantillon pour une concentration finale de DTT de 0,5 millimolaire. Ajoutez le volume préparé de SHP-2 à chaque échantillon pour obtenir un volume final de 20 microlitres, et mélangez doucement à l’aide d’une micro-pipette. Enveloppez les couvercles des flacons d’échantillon avec du Parafilm pour éviter les fuites ou la contamination croisée. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant deux heures sur un rotor à vitesse constante. Après avoir retiré les échantillons du rotor, arrêtez la réaction en ajoutant un millilitre de PBSA à chaque échantillon avant de les centrifuger à nouveau pendant une minute. Jetez ensuite le surnageant. Remettez en suspension les échantillons granulés dans un mélange de 20 microlitres de leurs réactifs primaires correspondants et incubez pendant 20 minutes à température ambiante. Après 20 minutes, centrifugez les échantillons à 4500G pendant une minute et jetez le surnageant comme déchet biologique dangereux. Lavez les cellules une fois en les remettant en suspension dans un millilitre de PBSA avant de centrifuger à nouveau les cellules. Maintenant, remettez les échantillons en suspension dans un mélange de 20 microlitres de leurs réactifs secondaires correspondants et incubez pendant 15 minutes dans l’obscurité. Après avoir centrifugé les échantillons et jeté le surnageant, laver les cellules une fois de plus avec du PBSA avant de les centrifuger à nouveau. Ensuite, mettez à nouveau en suspension les échantillons lavés dans 300 à 500 microlitres de PBSA et transférez-les dans des tubes en polystyrène de cinq millilitres pour l’analyse par cytométrie en flux. Après avoir préparé le cytomètre, cliquez sur Fichier, puis sur le bouton Nouvelle expérience, nommez l’expérience et cliquez sur Enregistrer pour vous assurer que les données acquises sont enregistrées dans le chemin d’accès au fichier souhaité. Sélectionnez l’icône de graphique à points dans la barre d’outils supérieure pour créer deux ou plusieurs graphiques à points pour chaque échantillon. Pour l’un des diagrammes à points, assurez-vous que le nom de l’axe des x affiche le canal FSCA et que le nom de l’axe des y affiche le canal SSCA. Pour un autre graphique, sélectionnez le nom de l’axe des x pour afficher le canal dans lequel le réactif secondaire ciblant l’anticorps anti-marqueur anti-épitope primaire est fluorescent, et le nom de l’axe des y pour afficher le canal dans lequel le réactif secondaire de la streptavidine est fluorescent. Donnez un nom descriptif à l’échantillon en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le tube, en sélectionnant Modifier le nom et en saisissant le nom de l’échantillon. Placez chaque tube d’échantillon dans le support du cytomètre et cliquez sur Exécuter pour commencer à charger l’échantillon et à acquérir des données. Ajustez les événements, le temps et le débit si nécessaire. Définir une porte autour des cellules de levure saines dans le graphique SSCA par rapport à la FSCA. Enregistrez ensuite la fluorescence de tous les échantillons de contrôle. Définissez une stratégie de contrôle pour le tracé créé avant d’analyser les échantillons traités. Enregistrez la fluorescence des échantillons déphosphorylés à l’aide du cytomètre et de la stratégie de contrôle avant d’analyser les données à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux. Évaluez la phosphorylation en mesurant et en comparant la médiane de l’axe y des cellules exprimant des protéines à leur surface, et la phosphorylation de base fournie par les cellules non joueuses entre les échantillons et les témoins. Enfin, calculez le pourcentage de différence médiane de phosphorylation à l’aide de la formule fournie. L’effet de la variation des concentrations de SHP-2 phosphatase et des temps d’incubation sur la différence médiane de phosphorylation dans les substrats exposés à la surface de la levure est illustré dans cette figure. Le pourcentage médian de différence de phosphorylation a diminué au fil du temps pour toutes les concentrations de SHP-2, la déphosphorylation la plus élevée étant observée à une concentration de 1 000 nanomolaires de SHP-2 à quatre heures. Après deux heures d’incubation, 1 000 nanomolaires de SHP-2 ont entraîné une différence de phosphorylation médiane d’environ 48,8 %, ce qui est nettement inférieur à la condition de 750 nanomolaires au même moment. Aucune différence significative dans la différence médiane de phosphorylation n’a été observée lorsque l’incubation a été prolongée de deux à trois heures pour des concentrations de SHP-2 de 500 nanomolaires, 750 nanomolaires et 1 000 nanomolaires.