Name: Modification enzymatique et évaluation par cytométrie en flux des protéines affichées à la surface de la levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Découvrez une méthode d'affichage de protéines à la surface de la levure pour évaluer les modifications enzymatiques par cytométrie en flux. Cette approche permet d'étudier la déphosphorylation et la cinétique enzymatique de manière simplifiée.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Croissance cellulaire de la levure hébergeant le plasmide et induction de l’expression des protéines
<ol>
	<li>En suivant la recette décrite dans le tableau 1, préparer les milieux nécessaires à la croissance des levures non plasmidiques (YPD), à la croissance des cellules de levure contenant des plasmides (SD-CAA) et à l’induction de l’expression des protéines (SRG-CAA) ainsi que les plaques SD-CAA.</li>
	<li>Transformez l’ADN plasmidique d’affichage de levure contenant la paire kinase-substrat en cellules de levure EBY-100 grâce à la méthode à base de cations lithium30,31, couramment adoptée pour une utilisation dans les kits de transformation de levure de divers fabricants. REMARQUE : L’électroporation32 ou d’autres techniques de transformation de plasmide de levure préférées peuvent être utilisées en fonction de la construction du plasmide transformée.</li>
	<li>Préparez un tube de culture de 14 mL avec 10 mL de milieu YPD. Inoculer les cellules EBY-100 et les faire croître dans un incubateur à 30 °C, 300 tr/min jusqu’à ce que la culture atteigne une densité optique (DO600 nm) de 0,8-1,0 (8 x 106- 1 x 107 cellules/mL). REMARQUE : Le diamètre extérieurde 600 nm est mesuré en préparant des cuvettes d’échantillon de 3 mL contenant des dilutions 1:10 de cultures de levure dans leurs milieux respectifs et des cuvettes vierges de 3 mL contenant les milieux utilisés pour les dilutions des échantillons. Le programme OD600nm sur le spectrophotomètre permet de mesurer d’abord la cuvette à blanc, puis chaque cuvette d’échantillon en réglant la dilution correspondante préparée pour chaque échantillon. 1 DO600nm correspond à 1 ×10 7 levure/mL.</li>
	<li>Récolter les cellules en centrifugeant la culture à 1 000 x g pendant 3 min, et laver avec la1ère solution de lavage fournie dans le kit de transformation de levure, ou TE (10 mM Tris-HCl et 1,0 mM EDTA)31.</li>
	<li>Granulez à nouveau les cellules à 1 000 x g pendant 3 min et mettez-les en suspension dans 1 mL du tampon de transformation fourni dans le kit de transformation de levure, ou de l’eau stérile. Les cellules doivent être aliquotes en aliquotes de 50 μL et peuvent être stockées à -80 °C jusqu’à 6 mois.</li>
	<li>Pour la transformation du plasmide, une aliquote par plasmide est préparée et décongelée sur de la glace, puis 0,5 à 1,5 μg d’ADN plasmidique contenant la construction d’affichage de la levure est ajouté directement aux cellules. On ajoute 0,5 mL de la solution de transformation fournie dans le kit de transformation de levure, ou 0,5 mL d’une solution stérile de polyéthylène glycol à 50 % et de solution de LiOAc31 à 0,1 M. Combinez soigneusement le mélange de cellules, d’ADN plasmidique et de solution de transformation par pipetage.</li>
	<li>Incuber le mélange de transformation de manière statique pendant 30 à 60 min à 30 °C, le mélange vortex à 15 minutes d’intervalle. Récoltez les cellules par centrifugation à 1 000 × g pendant 3 min.</li>
	<li>Préparez un tube de culture de 14 mL avec 4,5 mL de milieu SD-CAA. Remettre en suspension les cellules contenant le plasmide désiré dans 500 μL de SD-CAA et inoculer les 4,5 mL préparés.</li>
	<li>En prenant soin de ne pas percer la gélose, répartir 50 μL des 5 mL de culture inoculée sur une plaque SD-CAA et incuber statiquement à 30 °C pendant 48 h pour déterminer l’efficacité de la transformation.</li>
	<li>Incuber les 5 mL de culture cellulaire SD-CAA dans un incubateur à agitation à 30 °C, 300 tr/min pendant au moins 18 h. Surveiller la densité optique (OD600nm) après 16 h et 20 h. Une fois que l’échantillon a atteint une densité optique suffisante ne dépassant pas 6, centrifuger la culture pendant 3 min à 2 500 × g. Jetez le surnageant sans déranger la pastille de levure.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille de levure dans le SRG-CAA jusqu’à une DO finale de600 nm inférieure à 1 (&lt;1 × 107 levure/mL).</li>
	<li>Incuber la culture de levure dans un incubateur à agitation à 30 °C, 300 tr/min pendant au moins 8 h mais pas plus de 24 h. REMARQUE : L’induction de l’expression des protéines dans les cellules de levure peut varier n’importe où de 20 à 37 °C. 30 °C convient à la synthèse des paires kinase/substrat29,33 mais peut être ajustée si nécessaire pour les protéines spécifiques étudiées.</li>
	<li>Mesurez la DO600 nm pour déterminer la densité cellulaire. REMARQUE : Le protocole peut être arrêté à ce stade en stockant les cultures de levure à 4 °C.</li>
</ol>
2. Biotinylation de l’anticorps anti-phosphotyrosine 4G10
<ol>
	<li>Remettre en suspension un flacon de 2 mg de PEG4-NHS-Biotine à une concentration finale de 5 mM en ajoutant 680 μL de PBS stérile. REMARQUE : La remise en suspension de PEG4-NHS-Biotine doit être effectuée immédiatement avant que la réaction de biotinylation ne soit effectuée. Le NHS s’hydrolyse en solution aqueuse. L’utilisation de PBS et de flacons stériles est importante pour la préparation des réactifs destinés à l’entreposage à long terme et pour l’utilisation dans les essais cellulaires afin d’atténuer les effets potentiels des contaminants sur la viabilité des réactifs ou les essais sensibles effectués.</li>
	<li>En fonction de la concentration d’anticorps 4G10, ajouter 100 μg d’anticorps dans un flacon stérile de 1,7 mL.</li>
	<li>Ajouter 1 μL de 5 mM de PEG4-NHS-Biotine préparée à partir de l’étape 2.1 dans le flacon contenant les 100 μg d’anticorps 4G10 pour obtenir un rapport molaire biotine/anticorps de 7,5:1. Pipeter doucement le mélange pour homogénéiser la réaction.</li>
	<li>Incuber la réaction à température ambiante avec une rotation constante pendant au moins 2 h.</li>
	<li>Suivre le protocole du fabricant pour les colonnes de dessalage par centrifugation de 0,5 mL afin d’échanger le tampon du 4G10 biotinylé (B-4G10) dans du PBS. REMARQUE : Les colonnes de dessalage avec une coupure de poids moléculaire (MWCO) de 7 kDa sont couramment utilisées pour la biotinylation des anticorps afin de permettre l’élimination de la biotine et d’autres petites molécules n’ayant pas réagi tout en conservant l’anticorps plus gros.</li>
	<li>Diluer l’anticorps B-4G10 jusqu’à une concentration finale de 1 μM dans du PBSA (PBS avec 1 g/L d’albumine sérique bovine). Aliquote l’anticorps B-4G10 en plus petits volumes pour éviter les cycles répétés de congélation/décongélation. REMARQUE : Les anticorps biotinylés peuvent être conservés à 4 °C pour une utilisation quotidienne jusqu’à 3 mois sans perte d’efficacité significative. Conservez le reste des aliquotes non utilisées à -20 °C pendant un maximum de 2 ans.</li>
</ol>
3. Déphosphorylation des substrats exprimés à la surface des cellules de levure
<ol>
	<li>Préparez la solution tampon 2x de travail comme décrit précédemment dans la littérature34. REMARQUE : 2x est recommandé pour faciliter la mesure des ingrédients nécessaires.</li>
	<li>Préparez le tampon de travail pour les échantillons dans un flacon de 1,7 mL en diluant la solution tampon 2x préparée à l’étape 3.1 1:2 dans de l’eau désionisée. REMARQUE : Le volume total de réaction pour chaque échantillon sera de 20 μL, et chaque échantillon nécessitera entre 10 μL et 18 μL de tampon de travail. Préparez suffisamment de tampon de travail pour tous les échantillons ou commandes.</li>
	<li>Après la préparation recommandée de l’échantillon décrite au tableau 2, étiqueter les flacons de 1,7 mL avec le témoin ou le nom de l’échantillon correspondant.</li>
	<li>Sur la base de la DOde 600 nm mesurée à l’étape 1.9, calculez le volume de culture nécessaire pour récupérer deux millions (2 × 106) de cellules de levure à partir de la culture de levure correspondante pour chaque échantillon.</li>
	<li>Ajouter le volume de culture de levure calculé à l’étape précédente dans le flacon de 1,7 mL pour chaque échantillon.</li>
	<li>Centrifugez le flacon pendant 1 min à 4 500 × g. Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une micropipette et le jeter comme déchet biologique.</li>
	<li>Remettre les cellules granulées en suspension dans 1 mL de PBSA et répéter l’étape 3.6. REMARQUE : Il est important d’éliminer autant de surnageant que possible sans déranger les cellules granulées.</li>
	<li>D’après sa concentration de stock, calculer le volume de SHP-2 humain recombinant requis pour avoir une concentration finale de 1 000 nM dans un volume de réaction total de 20 μL. REMARQUE : Le SHP-2 recombinant doit être aliquote en petites quantités de sorte que toute protéine utilisée dans chaque essai n’ait pas subi plus de deux cycles de congélation-décongélation. Tout résidu de SHP-2 provenant d’une aliquote après que tous les échantillons ont été préparés pour un essai doit être jeté. Les concentrations de stock d’enzymes recombinantes peuvent varier en fonction du numéro de lot. Le SHP-2 recombinant est couramment formulé à une concentration de base de 0,2 à 0,4 mg/mL. Pour une concentration mère de 0,324 mg/mL SHP-2, cela correspond à une concentration mère de 4,696 μM (SHP-2 a un poids moléculaire de 69 kDa). 4,26 μL de la matière première de SHP-2 dans une réaction de 20 μL donnent une concentration de réaction finale de 1 000 nM de SHP-2.</li>
	<li>Ajouter 7,7 mg de DTT dans 10 mL d’eau déminéralisée préparée dans un cône de 15 mL pour créer une solution de DTT de 5 mM. Si les limites de l’équipement rendent difficile la pesée des milligrammes, ajoutez 0,77 g de DTT à 10 ml d’eau désionisée, puis effectuez une dilution 100x pour créer la solution de DTT de 5 mM utilisée pour le dosage. REMARQUE : La solution DTT peut être préparée dans des solutions mères à concentration plus élevée pour être diluée à 5 mM s’il n’est pas possible de mesurer des quantités à l’échelle du milligramme à l’aide de l’équipement disponible. La solution de DTT doit être préparée fraîche avant la remise en suspension de la cellule dans le tampon de travail en raison de sa tendance à l’hydrolyse, ce qui la rend instable sur de longues périodes lorsqu’elle est diluée dans l’eau.</li>
	<li>Remettre les cellules granulées en suspension dans le tampon de travail préparé à l’étape 3.2 de sorte que le volume de réaction final dans chaque échantillon ou témoin soit de 20 μL. REMARQUE : La quantité de tampon de travail ajoutée doit être calculée en fonction de la quantité de DTT (2 μL) et de SHP-2 (calculée à l’étape 3.8) qui se trouvera dans chaque échantillon.</li>
	<li>Ajouter 2 μL de la solution de DTT 5 mM préparée à l’étape 3.9 à chaque échantillon ou témoin pour une concentration de réaction finale de 0,5 mM de DTT.</li>
	<li>Ajouter le volume de SHP-2 calculé à l’étape 3.8 à chaque échantillon pour un volume final de 20 μL et mélanger délicatement à l’aide d’une micropipette.</li>
	<li>Enveloppez les couvercles des flacons d’échantillon dans un parafilm pour éviter les fuites ou la contamination croisée.</li>
	<li>Incuber les échantillons à 37 °C pendant 2 h sur un rotor à vitesse constante.</li>
	<li>Retirer les échantillons du rotor et arrêter la réaction en ajoutant 1 mL de PBSA à chaque échantillon.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.6.</li>
</ol>
4. Marquage cellulaire et analyse par cytométrie en flux de substrats déphosphorylés
<ol>
	<li>Mettre en suspension les échantillons de l’étape 3.16 dans un mélange de 20 μL de leurs réactifs primaires correspondants, comme décrit dans le tableau 2. Incuber les échantillons pendant 20 min à température ambiante. REMARQUE : Il a été calculé que toutes les concentrations de réactifs utilisées étaient supérieures au nombre de protéines exprimées à la surface des cellules de levure. Le calcul suppose l’expression de 10 000 protéines/cellule à partir de toutes les levures 2 x 106 dans un échantillon35, alors que seulement ~50 % d’entre elles le font habituellement. Le tableau 3 montre le rapport de réactif de marquage en excès pour chacun des réactifs exprimé dans le tableau 2, calculé comme suit : 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq1v3.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Centrifugez les échantillons à 4 500 × g pendant 1 min et jetez le surnageant en tant que déchet biologique dangereux.</li>
	<li>Laver les cellules une fois en les mettant en suspension dans 1 mL de PBSA. Répétez l’étape 4.2.</li>
	<li>Remettre en suspension les échantillons dans un mélange de 20 μL de leurs réactifs secondaires correspondants, comme décrit dans le tableau 2. Incuber les échantillons pendant 15 min en l’absence de lumière.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.2.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.3.</li>
	<li>Remettre en suspension les échantillons lavés dans 300 à 500 μL de PBSA et les transférer dans des tubes de polystyrène de 5 mL pour les analyser immédiatement à l’aide d’un cytomètre en flux approprié. REMARQUE : Si des échantillons doivent être transportés, conservez-les sur de la glace humide. Ce n’est pas recommandé, mais les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pendant un maximum de 2 h sous forme de granulés humides.</li>
	<li>Après avoir effectué le démarrage et la préparation nécessaires du cytomètre pour une nouvelle expérience, cliquez sur le bouton Nouvelle expérience dans le menu Fichier , nommez l’expérience, puis cliquez sur Enregistrer pour vous assurer que les données acquises sont enregistrées dans le chemin d’accès au fichier souhaité.</li>
	<li>Sélectionnez l’icône de pointage dans la barre d’outils supérieure pour créer deux point-plots ou plus pour chaque échantillon à exécuter. Pour l’un des diagrammes à points, sélectionnez le nom de l’axe X pour afficher le canal FSC-A et le nom de l’axe Y pour afficher le canal SSC-A. Ce graphique montre l’aire de dispersion latérale par rapport à l’aire de diffusion directe et est utilisé pour bloquer les cellules de levure pour une analyse plus approfondie.</li>
	<li>Sur un autre graphique à points, sélectionnez le nom de l’axe X pour afficher le canal dans lequel le réactif secondaire ciblant l’anticorps anti-épitope primaire devient fluorescent. Sélectionnez le nom de l’axe Y pour afficher le canal dans lequel le réactif secondaire de la streptavidine devient fluorescent. Ce graphique ne montrera que les événements contrôlés par le biais du graphique de dispersion latéral par rapport au graphique de dispersion vers l’avant en tant que cellules de levure et est utilisé pour afficher la phosphorylation de la tyrosine sur l’axe Y et l’expression de surface du substrat sur l’axe X. REMARQUE : Dans cet exemple, le réactif secondaire ciblant l’anticorps anti-épitope primaire est fluorescent dans le canal FITC (AF-488) et le réactif secondaire de la streptavidine dans le canal AF-647. Les canaux utilisés peuvent varier en fonction des réactifs primaires et secondaires utilisés lors de l’étiquetage.</li>
	<li>Placez chaque tube d’échantillon dans le support de tube du cytomètre et sélectionnez Exécuter pour que le cytomètre commence à charger l’échantillon et à acquérir des données. Ajustez les événements à afficher, les événements à enregistrer, le temps d’enregistrement et le débit d’échantillon si nécessaire.</li>
	<li>Définissez une porte autour des cellules de levure saines dans le graphique SSC-A vs FSC-A créé à l’étape 4.9. La figure 1 illustre une représentation descriptive de la stratégie de contrôle à appliquer. REMARQUE : Sur le graphique SSC-A par rapport au graphique FSC-A, 100 000 événements à afficher et 50 000 événements à enregistrer dans la porte de levure définie constituent une bonne ligne directrice pour visualiser et collecter suffisamment de données pour une analyse plus approfondie. Des stratégies de contrôle plus strictes pour sélectionner la levure singulet peuvent être appliquées sur la base d’un graphique de la hauteur de dispersion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion vers l’avant, comme récemment signalé36. La stratégie de déclenchement illustrée à la figure 1 correspond à une approche moins stricte, incluant la levure singulet et un peu de levure doublet par le biais d’un désaccord de dispersion.</li>
	<li>Enregistrez la fluorescence de tous les échantillons de contrôle à l’aide d’un analyseur de cytométrie en flux. Des échantillons de contrôle sont systématiquement prélevés en premier pour aider à définir une stratégie de contrôle, comme décrit ci-dessous à l’étape 4.14.</li>
	<li>Définissez une stratégie de contrôle pour votre parcelle créée à l’étape 4.10 avant d’analyser les échantillons traités. La figure 1 illustre une représentation descriptive de la stratégie de contrôle à appliquer.</li>
	<li>Enregistrer la fluorescence des échantillons déphosphorylés à l’aide du cytomètre en flux et de la stratégie de déclenchement définie aux étapes 4.12 et 4.14.</li>
	<li>Analysez les données de cytométrie en flux acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux.</li>
	<li>Évaluez la déphosphorylation en mesurant et en comparant la médiane de l’axe Y des cellules exprimant des protéines à leur surface et la phosphorylation de base fournie par les cellules non affichées entre les échantillons et les témoins. Calculez le pourcentage de différence médiane de phosphorylation comme suit : 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq2v5.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

<ol><li>Lea, M. A., Weber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+enzymes+in+homeostasis%3A+VIII.+Inhibition+of+the+activity+of+glycolytic+enzymes+by+free+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of enzymes in homeostasis: VIII. Inhibition of the activity of glycolytic enzymes by free fatty acids.</a> J Biol Chem. 243 (6), 1096-1102 (1968).</li>
<li>Mahé, M., Rios-Fuller, T. J., Karolin, A., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+enzymatic+dysfunctions+in+metabolic+disorders+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genetics of enzymatic dysfunctions in metabolic disorders and cancer.</a> Front Oncol. 13, 1230934(2023).</li>
<li>Fernandez-de-Cossio-Diaz, J., Vazquez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A physical model of cell metabolism.</a> Sci Rep. 8 (1), 8349(2018).</li>
<li>Metallo, C. M., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+metabolic+regulation+and+its+influence+on+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Understanding metabolic regulation and its influence on cell physiology.</a> Mol Cell. 49 (3), 388-398 (2013).</li>
<li>Mildvan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+signaling+and+related+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of signaling and related enzymes.</a> Proteins. 29 (4), 401-416 (1997).</li>
<li>Frosina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+enzymes+that+repair+endogenous+damage+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Overexpression of enzymes that repair endogenous damage to DNA.</a> Eur J Biochem. 267 (8), 2135-2149 (2000).</li>
<li>Schärer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of DNA repair.</a> Angew Chem Int Ed. 42 (26), 2946-2974 (2003).</li>
<li>de la Fuente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+therapy%3A+Current+challenges+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Enzyme therapy: Current challenges and future perspectives.</a> Int J Mol Sci. 22 (17), 9181(2021).</li>
<li>Robertson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+as+a+special+class+of+therapeutic+target%3A+clinical+drugs+and+modes+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymes as a special class of therapeutic target: clinical drugs and modes of action.</a> Curr Opin Struct Biol. 17 (6), 674-679 (2007).</li>
<li>Goddard, J. -P., Reymond, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+assays+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme assays for high-throughput screening.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (4), 314-322 (2004).</li>
<li>Helm, J. S., Hu, Y., Chen, L., Gross, B., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+active-site+inhibitors+of+MurG+using+a+generalizable%2C+high-throughput+glycosyltransferase+screen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Identification of active-site inhibitors of MurG using a generalizable, high-throughput glycosyltransferase screen.</a> J Am Chem Soc. 125 (37), 11168-11169 (2003).</li>
<li>Veldhuyzen, W. F., Nguyen, Q., McMaster, G., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-activated+probe+of+intracellular+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A light-activated probe of intracellular protein kinase activity.</a> J Am Chem Soc. 125 (44), 13358-13359 (2003).</li>
<li>Torres, M., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorres%2C+M+%22Encyclopedia+of+Respiratory%22">Encyclopedia of Respiratory</a>. Laurent, G. J., Shapiro, S. D. , Academic Press. 10-18 (2006).</li>
<li>Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+kinase+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogenic kinase signalling.</a> Nature. 411 (6835), 355-365 (2001).</li>
<li>Martin, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling and cancer.</a> Cancer Cell. 4 (3), 167-174 (2003).</li>
<li>Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+post-translational+modification+codes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Deciphering post-translational modification codes.</a> FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).</li>
<li>Graves, J. D., Krebs, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphorylation+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Protein phosphorylation and signal transduction.</a> Pharmacol Ther. 82 (2), 111-121 (1999).</li>
<li>Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinases+and+phosphatases--A+marriage+is+consummated%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinases and phosphatases--A marriage is consummated.</a> Science. 280 (5367), 1212-1213 (1998).</li>
<li>Westphal, R. S., Anderson, K. A., Means, A. R., Wadzinski, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signaling+complex+of+Ca2%2B-calmodulin-dependent+protein+kinase+IV+and+protein+phosphatase+2A%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A signaling complex of Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase IV and protein phosphatase 2A.</a> Science. 280 (5367), 1258-1261 (1998).</li>
<li>Barford, D., Das, A. K., Egloff, M. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+mechanism+of+protein+phosphatases%3A+Insights+into+catalysis+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">The structure and mechanism of protein phosphatases: Insights into catalysis and regulation.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 27, 133-164 (1998).</li>
<li>Liu, Q., Qu, J., Zhao, M., Xu, Q., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SHP2+as+a+promising+strategy+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting SHP2 as a promising strategy for cancer immunotherapy.</a> Pharmacol Res. 152, 104595(2020).</li>
<li>Pan, J., Zhou, L., Zhang, C., Xu, Q., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+phosphatases+for+the+treatment+of+inflammation-related+diseases%3A+From+signaling+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Targeted+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting protein phosphatases for the treatment of inflammation-related diseases: From signaling to therapy.</a> Signal Transduct Targeted Ther. 7 (1), 177(2022).</li>
<li>Denard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YESS+2.0%2C+a+tunable+platform+for+enzyme+evolution%2C+yields+highly+active+TEV+protease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants.</a> ACS Synth Biol. 10 (1), 63-71 (2021).</li>
<li>Lim, S., Glasgow, J. E., Filsinger Interrante, M., Storm, E. M., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+display+of+proteins+on+the+yeast+cell+surface+simplifies+quantification+of+binding+interactions+and+enzymatic+bioconjugation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Dual display of proteins on the yeast cell surface simplifies quantification of binding interactions and enzymatic bioconjugation reactions.</a> Biotechnol J. 12 (5), (2017).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+TEV+protease+variants+by+yeast+ER+sequestration+screening+%28YESS%29+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endoplasmic+reticulum+sequestration+screening+for+the+engineering+of+proteases+from+libraries+expressed+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast.</a> Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).</li>
<li>Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERD2%2C+a+yeast+gene+required+for+the+receptor-mediated+retrieval+of+luminal+ER+proteins+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway.</a> Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).</li>
<li>Mei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+aromatic+residue-controlled+protein+retention+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of aromatic residue-controlled protein retention in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 292 (50), 20707-20719 (2017).</li>
<li>Ezagui, J., Russell, B., Mairena, Y., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+sequestration+empowers+phosphorylation+profiling+on+the+yeast+surface%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum sequestration empowers phosphorylation profiling on the yeast surface.</a> AIChE J. 68 (12), e17931(2022).</li>
<li>Kawai, S., Murata, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKawai%2C+S+%22Genetic+Transformation+Systems+in+Fungi%22">Genetic Transformation Systems in Fungi</a>. van den Berg, M. A., Maruthachalam, K. 1, Springer International Publishing. 187-192 (2015).</li>
<li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi%3A+methods+and+possible+underlying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li>
<li>Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+and+expression+of+genomic+libraries+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation and expression of genomic libraries in yeast.</a> Methods Protoc. 6 (5), 89(2023).</li>
<li>Huang, D., Gore, P. R., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+yeast+secretion+of+heterologous+proteins+by+regulating+expression+rates+and+post-secretory+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Increasing yeast secretion of heterologous proteins by regulating expression rates and post-secretory loss.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1264-1275 (2008).</li>
<li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+for+the+treatment+of+PTPN11-associated+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting protein tyrosine phosphatase SHP2 for the treatment of PTPN11-associated malignancies.</a> Mol Cancer Ther. 12 (9), 1738-1748 (2013).</li>
<li>Stern, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+and+expression+enhance+enrichment+of+functional+yeast-displayed+ligands+via+cell+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Geometry and expression enhance enrichment of functional yeast-displayed ligands via cell panning.</a> Biotechnol Bioeng. 113 (11), 2328-2341 (2016).</li>
<li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+single-cell+gates+for+yeast+display+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Design+Sel%22%5BJournal%5D)">Optimized single-cell gates for yeast display screening.</a> Protein Eng Design Sel. 38, gzae018(2025).</li>
<li>Margittai, É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+H2O2+in+the+endoplasmic+reticulum+promotes+in+vivo+disulfide+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Production of H2O2 in the endoplasmic reticulum promotes in vivo disulfide bond formation.</a> Antioxid Redox Signal. 16 (10), 1088-1099 (2012).</li>
<li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol Rev. 57 (2), 383-401 (1993).</li>
<li>Ezagui, J., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+screening+on+the+yeast+surface+by+magnetic+bead+selection+and+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation screening on the yeast surface by magnetic bead selection and FACS.</a> Methods Mol Biol. 2681, 275-290 (2023).</li>
<li>Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+SHP2+and+SHP1+protein+tyrosine+phosphatase+domains+by+a+non-conserved+%E2%80%9Cbackdoor%E2%80%9D+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine.</a> Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).</li>
<li>Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+tyrosine+kinase+signalling%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye.</a> J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).</li>
<li>Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titratable+avidity+reduction+enhances+affinity+discrimination+in+mammalian+cellular+selections+of+yeast-displayed+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands.</a> ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).</li>
<li>Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+residue+specificities+of+epigenome+enzymes+by+yeast+surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display.</a> Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Bouteilles de 1 L de média</td><td>Corning</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1,7/2,0 mL Microtubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro ; L SureOne Pointes de pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-438</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro ; L SureOne Pipette Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-408</td><td></td></tr><tr><td>12 mL Polystyrène Tubes à fond rond</td><td>Greiner</td><td>07-000-212</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Cuvettes en plastique</td><td>BRAND</td><td>759076D</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro ; L SureOne Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques de 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Caséine acide (acides casaminés)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1424-500</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique&nbsp ;</td>Boîte de Pétri bactériologique <td>30243397</td><td></td> <td>Mettler Toledo</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td>Armoires de biosécurité <td>Corning</td><td>Falcon 351008</td><td></td></tr><tr><td>Biospectromètre</td><td>Labconco</td><td>Logic Classe II, type A2 302310102</td><td></td></tr><tr><td>Biospectromètre</td><td>Eppendorf</td><td>Kinetic 6136000010</td><td></td></tr><tr><td>Bovin Sérum</td><td>Albumine Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Cytométrie en flux Analyseur&nbsp ;</td><td>Beckam Coulter</td><td>Cytoflex C09745</td><td>CytExpert logiciel</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher bioréactifs</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-chèvre FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A16000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>H56165.30</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Link PEG4-NHS-Biotine</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39259</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transformation de levure Frozen-EZ II&nbsp ;</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur à usage général</td><td>Marvel Scientific</td><td>MS24RAS4RW</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-myc tag de chèvre&nbsp ;</td><td>Centrifugeuse</td> à tube Mictrotube <td>Bethyl A190-104A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5425 R 5406000313</td><td></td></tr><tr><td>Mini incubateur réfrigéré à basse température</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2632</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-phosphotyrosine de souris 4G10</td><td>BioXcell</td><td>BE0194</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>M PM999</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate&nbsp ;</td><td>Fisher bioréactifs</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de pipettes&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>easypet 3 4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Thermo Scientific</td><td>J21060-36</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humain Actif SHP-2 Protéine</td><td>R& D Systems</td><td>1894-SH</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae levure présentoir surface souche EBY 100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0002 Nouveau-Brunswick Innova 42&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Jeu de pipettes monocanal·e·s</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium dihydraté</td><td>Fisher</td><td>Scientific S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique heptahydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique monohydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Balance à chargement par le haut</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris chlorhydrate</td><td>EMD Millipore</td><td>648317-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Tube revolver rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-341</td><td></td></tr><tr><td>Pesée Papier&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr><tr><td>Base d’azote</td><td>de levure BD Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage Zeba Spin&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

modification enzymatique et évaluation par cytométrie en flux des protéines affichées à la surface de la levure

Enzymatic Modification and Flow Cytometry Assessment of Yeast Surface Displayed Proteins

L’analyse par cytométrie en flux d’une réplique individuelle de notre système modèle incubée pendant 2 h sans (Figure 1A) et avec (Figure 1B) 1 000 nM SHP-2 révèle une différence de phosphorylation médiane de 63,6 %, qui est définie comme le rapport de la médiane de l’axe Y (phosphorylation) de tous les événements affichés en surface moins le signal de phosphorylation de base défini comme la médiane de l’axe Y des événements non affichés entre l’échantillon trai...

Modification enzymatique et évaluation par cytométrie en flux des protéines affichées à la surface de la levure

Yeast surface display is a genotype-phenotype linkage strategy that empowers high-throughput screening of protein function. Traditionally, yeast surface ...

enzymatic-modification-flow-cytometry-assessment-yeast-surface

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Une approche robuste pour surveiller la prestation des organites à la lumière acide de la vacuole de la levure pour la dégradation et le recyclage est décrite. La méthode repose sur le marquage spécifique des organites cibles avec un codées génétiquement double-émission de fluorescence pH-biocapteur, et la visualisation des cellules individuelles en utilisant la microscopie à fluorescence.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Deux méthodes complémentaires basées sur la cytométrie en flux et la microscopie sont présentées qui permettent la quantification, au niveau de la cellule unique, de la dynamique de l'expression génique induits par l'activation d'une voie de MAPK dans la levure.

Quantification temporelle d&#39;expression MAPK induite en simples cellules de levure

Cet article décrit un test basé sur la croissance de levure pour la détermination des exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Il fait également la démonstration d’une méthode d’extraction rapide des protéines de levure, adaptée au western blot pour confirmer biochimiquement les exigences de dégradation. Ces techniques peuvent être adaptées pour surveiller la dégradation d’une variété de protéines.

Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

La quantification précise des événements de trafic vésiculaire fournit souvent des informations clés sur les rôles de protéines spécifiques et les effets des mutations. Cet article présente des méthodes d’utilisation de la supécliptique pHluorin, une variante de la GFP sensible au pH, comme outil de quantification des événements endocytaires dans les cellules vivantes à l’aide de la microscopie à fluorescence quantitative et de la cytométrie en flux.

Applications de pHluorin pour Quantitative, Kinetic et à haut débit Analyse des endocytose dans la levure bourgeonnante

Agrégation de la protéine provoque un stress oxydatif cellulaire. Ce protocole décrit une méthode pour surveiller les États intracellulaires des protéines amyloïdogène et le stress oxydatif qui leur sont associés, à l’aide de cytométrie en flux. L’approche est utilisée pour étudier le comportement des variantes solubles et sujette à l’agrégation du peptide amyloïde-β.

Évaluation de l’Impact de l’agrégation de protéines sur le Stress oxydatif cellulaire chez la levure

Cet article décrit un protocole de cytométrie de flux basé sur FRET pour quantifier l'auto-assemblage de protéine dans les deux cellules de S. cerevisiae et de HEK293T.

Détection et caractérisation de l'auto-assemblage des protéines in Vivo par la cytométrie des flux

Ce protocole décrit les étapes essentielles pour mener des campagnes de sélection de présentation de surface de levure afin d’enrichir les variants protéiques se liant à un antigène d’intérêt.

Ingénierie des protéines par affichage de surface de levure

Nous présentons ici un protocole permettant de quantifier la survie post-stress dans des échantillons de levures. Le test utilise deux colorants fluorescents, SYTO 9 et l’iodure de propidium (PI), pour quantifier l’intégrité de la membrane plasmique. Il utilise la cytométrie en flux pour fournir des estimations quantitatives et reproductibles des fractions cellulaires vivantes, mortes et endommagées pour les échantillons de stress post-oxydatif.

Un test LIVE/DEAD optimisé couplé à la cytométrie en flux pour quantifier la survie post-stress dans les cellules de levure

Dans cet article, nous décrivons une méthode utilisant multi-spectrale cytométrie de flux d'imagerie pour quantifier l'internalisation des nanoparticules ou des bactéries polyanhydride par des cellules RAW 264.7.

Analyser l&#39;internalisation cellulaire de nanoparticules et de bactéries multi-spectrale par cytométrie de flux d&#39;imagerie

Découvrez une méthode d'affichage de protéines à la surface de la levure pour évaluer les modifications enzymatiques par cytométrie en flux. Cette approche permet d'étudier la déphosphorylation et la cinétique enzymatique de manière simplifiée.

Modification enzymatique et évaluation par cytométrie en flux des protéines affichées à la surface de la levure

Explorer plus de vidéos