Flux de travail à l’aide d’un microscope cryogénique à fluorescence coïncidente, à faisceau d’électrons et d’ions pour le broyage ciblé de cellules

Mes recherches développent des méthodes de microscopie optique pour préserver les caractéristiques cellulaires dans les lamelles cryogéniques lors du fraisage par faisceau d’ions focalisés, permettant une analyse détaillée par tomographie électronique cryogénique pour découvrir l’organisation biologique native. La microscopie optique a été intégrée dans les systèmes CryoFIB-SEM, mais rarement à la même position que la FIB. Cela nécessite des approches de guidage basées sur l’enregistrement pour préserver les cibles marquées fluorescentement dans les lamelles finales.

Pour commencer, refroidissez manuellement la station de transfert à l’aide d’azote liquide une fois que l’étage a atteint des températures cryogéniques. Chargez une autogrille clippée dans la cassette d’échantillons conçue pour le système de microscopie optique cryogénique. Assurez-vous que l’autogrille est positionnée entre le couloir de couvercle collé et l’entretoise.

Serrez la vis annulaire pour fermer la cassette et insérez-la dans la fente de la station de transfert. Reliez la station de transfert au système de microscopie optique cryogénique. Utilisez la caméra de chambre interne pour guider la cassette d’échantillonnage vers l’étage d’échantillonnage.

Dans le logiciel de microscopie optique, déplacez l’étape de l’échantillon de la position de charge à la position prédéfinie des trois faisceaux. Dans le logiciel FIB-SEM, réglez le grossissement à 100X et cliquez sur la fenêtre en haut à gauche. Dans l’onglet d’alignement du logiciel de microscopie optique, cliquez sur Z et sélectionnez la fonction Play pour obtenir un atlas SEM de la grille.

Identifiez une zone carrée avec un film carbone cassé et double-cliquez dessus pour déplacer l’étape d’échantillonnage à cet endroit. Retour à l’interface logicielle. Activez la FIB et acquérez une image.

Ajustez le grossissement via le menu déroulant en haut à gauche. Appuyez sur Play pour afficher l’image FIB. Ensuite, réglez la taille du pas avec la barre de glissade.

Cliquez maintenant sur Z et Z pour ajuster la position de l’étape Z jusqu’à ce que la ligne horizontale présente dans l’ion et les images électroniques s’alignent avec la même caractéristique. Sélectionnez l’onglet SEM dans le logiciel de microscopie optique. Utilisez les boutons X et Y pour aligner une caractéristique commune entre les images SEM et ionique.

Maintenant, allume le microscope à fluorescence. Sélectionnez l’onglet FLM, définissez les conditions d’imagerie à lumière réfléchie, puis sélectionnez Lecture. Ensuite, alignez l’image à lumière réfléchie avec l’image SEM.

Zoomez sur l’image et cliquez sur l’option rectangle pour définir un motif de fraisage pour le faisceau d’ions. Appuyez sur Start Pattern dans l’affichage 2 pour fraiser un petit motif en utilisant le faisceau d’ions focalisé. Confirmez que le motif fraisé est visible à la fois dans le faisceau d’ions focalisé et dans les vues du microscope fluorescent.

Dans le logiciel de microscopie optique, allez à l’onglet Localisation et activez les conditions appropriées pour configurer les canaux fluorescents. Attribuez à chaque fluorophore un canal distinct et incluez un canal supplémentaire pour le champ clair. Ajustez la puissance de la LED et le temps d’exposition pour chaque canal fluorescent afin d’identifier la cible d’intérêt.

Une fois les paramètres satisfaisants, acquérir une pile z fluorescente pré-fraisée en passant par la direction axiale. Puis marquez la cible comme une région d’intérêt. Passez au logiciel FIB-SEM et dessinez une lamelle à la région d’intérêt.

Effectuez un fraisage grossier pour retirer le matériau en vrac tout en gardant le microscope à fluorescence allumé pour surveiller les changements de signaux. Ouvrez la boîte à outils interférométrique à base de Python depuis le terminal pour surveiller le signal fluorescent lors de l’amincissement des lamelles. Réduisez le ROI à environ deux micromètres en utilisant le mode de section efficace de nettoyage.

Pour une cible d’une étendue axiale supérieure à 300 nanomètres, dans l’interface graphique Python, sélectionnez la cible dans la micrographie de fluorescence. Le logiciel commence automatiquement à tracer la luminosité en fonction du temps à chaque nouvelle image. Surveillez l’intensité de fluorescence via la boîte à outils Python.

Fraisez l’échantillon en mode section transversale de nettoyage pour retirer tout film de soutien restant sous la région d’intérêt. Observez les chutes soudaines d’intensité de fluorescence comme indices pour changer de direction de fraisage. Si une forte diminution est observée lors du fraisage de bas en haut, arrêtez et commencez à fraiser de haut en bas.

Après avoir terminé le fraisage descendant, finaliser la lamelle en fraisant de bas en haut en mode section transversale de nettoyage jusqu’à atteindre l’épaisseur souhaitée. Puis capturez une image de fluorescence post-fraisage de la lamelle. Transférez l’échantillon vers un CryoTEM.

Chargez l’image de fluorescence multi-canal post-fraisage et l’image de projection CryoTEM dans le logiciel de transformation projective personnalisé pour l’enregistrement des régions d’intérêt. Sélectionnez maintenant huit à dix paires de points de référence visibles à la fois dans les images de fluorescence et de microscopie électronique pour calculer la transformation projective. Utilisez l’image superposée comme guide pour sélectionner une zone d’imagerie.

Ensuite, sélectionnez les paramètres de grossissement et d’acquisition appropriés pour la série d’inclinaison selon la taille de la structure cible et la résolution souhaitée. Les cellules macrophages différenciées marquées avec SiR-Tubuline présentaient un unique point fluorescent brillant, d’environ un micromètre de diamètre, correspondant au MTOC, ainsi que des structures de type fibromyalgie rayonnant vers la périphérie cellulaire cohérentes avec le réseau de microtubules. À mesure que l’échantillon était broyé à environ 800 nanomètres d’épaisseur, le point fluorescent unique MTOC se résolvait en deux taches distinctes, chacune d’environ 700 nanomètres de diamètre.

L’intensité de fluorescence a augmenté après le retrait du matériau en vrac non fluorescent et du film de support absorbant, suivie d’une forte diminution à mesure que la lamelle était encore plus amincie, passant de deux micromètres à moins de 200 nanomètres. La fluorescence cryogénique corrélée et la microscopie électronique ont permis un ciblage précis des structures lors du fraisage. Les tomographies reconstruites et les modèles segmentés révèlent que les centrioles sont composés de triplets microtubulaires.

Dans les cas où une seule tache fluorescente était retenue dans la lamelle finale, un seul centriole était visualisé dans le tomogramme correspondant. La précision de la fluorescence basée sur le millimilling est limitée par les approches de registration, qui souffrent beaucoup de résolution limitée par la diffraction, de désajustement de l’indice de réfraction, et aussi du mouvement induit par le fraisage. La microscopie optique simultanée et le fraisage FIB éliminent les erreurs de registre en utilisant à la place le retour en temps réel de la microscopie à fluorescence pour guider le processus de fraisage.

Cela évite les erreurs dues à la limite de diffraction et au désajustement de l’indice de réfraction, permettant un fraisage précis qui préserve les structures marquées par fluorescence pour la cryotomographie électronique au sein de la lamelle finale. Nos recherches permettent de voir des structures cellulaires auparavant difficiles à visualiser directement par cryoET, mettant en lumière les mécanismes moléculaires derrière un large éventail de machines micromoléculaires clés.