Synthèse de vésicules unilamellaires géantes composées : un modèle biomimétique de cellules nucléées

Cet article présente une méthode de préparation de vésicules unilamellaires géantes composées (cGUV) avec une structure vésicule dans vésicule, avec une conductivité électrique personnalisée dans les régions intérieures, annulaires et externes. L’électroformation synthétise des GUV simples, qui sont transformés en stomatocytes et en cGUVs par choc osmotique, fournissant un modèle précieux pour l’étude de la biophysique des cellules nucléées.

Nous avons mené une étude élaborée sur la synthèse et l’électrohydrodynamique de vésicules unilamellaires géantes composées afin de les établir comme des équivalents biomagnétiques de cellules eucaryotes. Il s’agit de comprendre les technologies impliquant l’application d’un champ électrique aux cellules biologiques, telles que l’électroporation et l’électrodéformation cellulaires.

Une combinaison d’une microscopie à fluorescence et d’une microscopie optique, de traitements électriques à impulsions nanosecondes, d’un oscilloscope et de sources d’alimentation, ainsi que de méthodes de synthèse innovantes est utilisée pour faire avancer la recherche dans ce domaine. Le défi de la synthèse de GUV composés bien formés dans la sensibilité d’une méthode à une température, à des types de lipides et à la composition utilisée. Dans ce travail, nous le démontrons pour un DMPC et un système de cholestérol, mais sa généralisation reste difficile. Des GUV simples qui imitent des cellules nucléiques ont été synthétisées dans la littérature. Nous synthétisons la vésicule géante composée pour émuler des cellules nucléées avec la structure de défense de la valve, enfermant une vésicule interne d’environ la moitié de la taille de la vésicule externe.

Nous nous concentrerons sur l’étude de l’effet des impulsions micro et nanosecondes sur la vésicule interne, qui est une imitation du noyau d’une cellule biologique dans le contexte de l’électroporation.

[Narrateur] Pour commencer, nettoyez soigneusement les lames d’oxyde d’indium et d’étain ou recouvertes d’ITO à l’aide d’une solution de savon à vaisselle et rincez-les à l’eau déminéralisée avec une conductivité de 0,055 microsiemens par centimètre. Ensuite, à l’aide d’une solution 100 % éthanol, nettoyez à nouveau les lames et rincez-les à l’eau déminéralisée. Faites sécher les lames dans un four réglé à 85 degrés Celsius. Identifiez le côté conducteur de chaque lame revêtue d’ITO à l’aide d’une pince ampèremétrique. Fixez la glissière propre sur la platine du codeur de spin à l’aide d’un aspirateur, en vous assurant que le côté conducteur est orienté vers le haut. Appliquez 25 microlitres de la solution lipidique, dont quatre gouttelettes sur le côté conducteur d’une lame d’ITO. Prenez une autre lame et appliquez 25 microlitres de la solution lipidique, deux de la même manière. Faites sécher sous vide les deux lames recouvertes de lipides dans un dessiccateur stocké dans l’obscurité pendant au moins deux heures. Disposez ensuite une lame ITO recouverte de lipides avec une lame lipidique en parallèle avec une lame propre, en vous assurant que les côtés conducteurs se font face, et placez une entretoise en caoutchouc de silicone de trois millimètres d’épaisseur entre elles. Scellez l’installation avec une pince pour créer une chambre d’électroformation. Remplissez maintenant la chambre avec une solution de saccharose de 100 millimolaires à l’aide d’une seringue de deux millilitres. Connectez le câble de sortie du générateur de fonctions aux glissières revêtues d’ITO avec le générateur de fonctions. Placez les deux chambres d’électroformation dans un incubateur maintenu entre 38 et 40 degrés Celsius. Appliquez un champ électrique de courant alternatif de cinq volts crête à crête à une fréquence de 10 hertz à l’aide d’un générateur de fonction à deux canaux pendant quatre heures. Après l’incubation, débranchez les chambres d’électroformation du générateur de fonctions. Retirez-les de l’incubateur et laissez-les refroidir à température ambiante. À l’aide d’une seringue, récoltez les vésicules unilamellaires géantes synthétisées de chaque chambre et transférez-les dans des tubes de microcentrifugation séparés de deux millilitres. Incuber les tubes à température ambiante entre 25 et 27 degrés Celsius pendant une heure avant de procéder au choc osmotique. Transférez 200 microlitres de vésicules unilamellaires géantes simples, ou sGUVs, en suspension dans un milieu hydratant contenant une solution de saccharose de 100 millimolaires dans la chambre d’observation, et introduisez 125 microlitres de solution de glucose de 300 millimolaires pour induire un choc osmotique et initier des transitions de forme. Laissez les sGUVs, actuellement soumis à un choc osmotique, reposer pendant une heure à l’intérieur de la chambre d’observation placée sur la platine de microscopie. Effectuez une microscopie à contraste interférentiel différentiel et à épifluorescence à l’aide d’un microscope inversé équipé d’une caméra monochromatique. Utilisez les objectifs Plan Fluor extra-longue distance de travail 20X par 0,45 et 40X par 0,60 pour observer les transitions de forme dans les sGUVs. Pour l’épifluorescence, utilisez un ensemble de filtres verts avec une excitation de 510 à 560 nanomètres, un miroir dichroïque à 575 nanomètres et un filtre barrière à 590 nanomètres pour les bicouches colorées en rouge Niall. Surveillez les transitions de forme dans la chambre d’observation à l’aide de la microscopie à contraste interférentiel différentiel et de l’épifluorescence avec les objectifs Plan Fluor. Observez la formation des vésicules stomatocytaires au fur et à mesure que la transition de forme se poursuit. Surveillez d’abord la façon dont les plus grandes vésicules se déposent, puis augmentez le nombre de petites vésicules au fil du temps. Ensuite, ajoutez une solution saline pour ajuster la conductivité dans différentes régions des cGUVs avant d’induire un choc osmotique. Par exemple, pour créer une conductivité plus élevée dans les régions externe et interne que dans la région annulaire, transférez 200 microlitres de solution de saccharose dans la chambre d’électrofusion. Ajoutez 20 microlitres de solution saline de 7,5 millimolaires dans la chambre et induisez un choc osmotique avec 125 microlitres de solution de glucose de 300 millimolaires. Laissez les sGUVs de choc osmotique reposer dans la chambre pendant trois à quatre heures. Confirmez que les cGUVs résultants ont une conductivité plus élevée dans les régions externe et interne par rapport à la région annulaire. Pour effectuer l’électrodéformation des cGUVs, espacez les fils-électrodes de 500 micromètres et appliquez un potentiel électrique de courant alternatif de 7,5 volts crête à crête à 100 kilohertz à l’aide d’un générateur de fonctions. Une fois le champ électrique appliqué, capturez une vidéo à 10 images par seconde et observez la déformation aplatie des vésicules externes et la déformation prolate des vésicules internes. Chargez ensuite le mélange cGUV dans une glissière de cavité et fermez-la avec une lamelle pour éviter tout mouvement. Utilisez un microscope confocal à balayage laser pour analyser la morphologie du cGUV à l’aide d’un balayage de l’axe Z avec une taille de pas d’un micromètre. Utilisez un objectif Plan Apochromat 40X par 1,3 lentille d’objectif DIC à l’huile pour l’imagerie. Utilisez un mode monocanal rouge avec une excitation de 561 nanomètres et une émission de 561 à 695 nanomètres pour imager cGUV coloré au Niall Red ou à la Rhodamine PE. Modifiez et extrayez le fichier . Fichier d’image CZI à l’aide du logiciel lié au microscope. Insérez des graphiques tels que des barres d’échelle et activez les vues 2D et 3D. Allez ensuite dans la méthode de traitement et les paramètres pour ajuster les paramètres souhaités. Cliquez ensuite sur Appliquer pour exporter l’image au format JPG. Enfin, ouvrez le fichier dans le logiciel ImageJ. Pour insérer une barre d’échelle, allez dans analyser, puis définissez l’échelle à calibrer, puis sélectionnez Analyser suivi des outils et de la barre d’échelle pour l’appliquer. L’imagerie confocale de la pile Z a confirmé que les vésicules internes étaient complètement séparées des vésicules externes et élevées dans le plan Z en raison de la densité plus faible de la solution interne. L’état stomatocytaire intermédiaire a montré un col étroit reliant les vésicules internes et externes avant la séparation complète. Une population diversifiée de formes vésiculaires, y compris de multiples vésicules internes, des corps en forme d’étoile et des structures tubulaires, a été observée six heures après le choc osmotique. Une grande abondance de cGUVs a été formée à l’aide d’un mélange lipidique de 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine et de cholestérol dans un rapport de 63 à 37 molaires. Sous un champ électrique à courant alternatif, les cGUVs ont montré une déformation, la vésicule externe formant une forme aplatie et la vésicule interne formant une forme prolate.