Modèle murin de maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique avec fibrose

Dans nos recherches, nous nous concentrons sur la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique, ou MASLD, et plus précisément sur les mécanismes d’accumulation lipidique et de fibrose. Parmi les développements récents figurent la transcriptomique unicellulaire et la transcriptomique spéciale, la standardisation des modèles animaux de MASLD, et l’approbation du sémaglutide pour le traitement de MASLD. Il existe de nombreux modèles animaux de MASLD, mais nous avons découvert que beaucoup n’induisaient pas de fibrose hépatique.

Pour répondre à ce point, nous avons développé notre modèle murin de MASLD. Notre modèle murin induit la MASLD avec fibrose en nourrissant des souris hyperphagiques avec un régime similaire à celui de la moyenne américaine. Cela provoque une MASLD très similaire à la maladie chez l’humain.

Notre méthode facilitera les études sur la physiopathologie de la MASLD et l’essai de nouvelles thérapies. Pour commencer, obtenez une section de tissu hépatique incrusté de paraffine sur une lame. Pour la déparaffinisation, immergez la lame dans du xylène ou du citrisolv pendant cinq à quinze minutes.

Puis réhydratez la coupe en série dans 100, 95 et 70 % d’éthanol, suivis d’eau distillée pendant cinq minutes dans chaque éthanol. Ensuite, tachez la section avec Sirius Red et déshydratez la lamelle. Retirez une lame à la fois de la solution de dégagement et appliquez-la sur du papier essuie-tout pour enlever l’excès de liquide.

Ajoutez environ 50 à 100 microlitres de milieu de montage à la section. Couvrez la section avec un couvercle et appuyez doucement pour éliminer les bulles d’air. Laissez la glissière sécher à l’air.

Observez maintenant la section préparée sous un microscope optique avec un éclairage en champ clair en utilisant des objectifs de 4x à 20x. Transférez environ 500 à 1000 microlitres d’homogénéat hépatique dans des tubes centrifugeuses de 1,5 millilitre, puis ajoutez de l’acide trichloroacétique pour atteindre une concentration finale de 12 %. Faites brièvement circuler le tube pour mélanger le contenu. Faites couver le tube dans un bain-marie glacé pendant 30 minutes, puis centrifugez-le à 6 000 g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, retirez le surnageant avec une pipette. Ajoutez un millilitre d’éthanol 100 % glacé pour laver la pellete et sonicez-la pour la resuspendre correctement. Après centrifugation de la suspension à nouveau, aspirez le surnageant.

Après le troisième lavage, laissez le tube ouvert pour laisser sécher le pellet à l’air libre pendant 10 minutes ou plus si nécessaire. Ensuite, ajoutez 800 microlitres de 6 acides chlorhydriques normaux dans le tube contenant la pastille de protéine, puis resuspendez la pellete à l’aide d’un sonicateur comme démontré précédemment. Transférez la suspension dans un tube en verre à bouchon ou un flacon à vis et scellez hermétiquement le capuchon.

Incubez le tube dans un four à 110 degrés Celsius pendant environ 22 heures. Si nécessaire, transférez le contenu du flacon en verre vers un tube centrifugeuse avant de tourner. Centrifugez l’échantillon hydrolysé à 16 000 g pendant 10 minutes et aspirez le surnageant contenant de l’hydroxyproline dans un tube de 1,5 millilitre.

Pour l’oxydation de l’hydroxyproline, ajoutez 450 microlitres de solution de chloramine dans des tubes contenant 50 microlitres d’échantillon et d’étalons. Mélangez le contenu des tubes avec un vortex, puis faites-les couver à température ambiante pendant 25 minutes. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de réactif d’Ehrlich à chaque échantillon et standard.

Après le vortex, incubez les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes dans un incubateur. Après l’incubation, laissez les tubes refroidir à température ambiante et observez la couleur finale des échantillons. Enfin, mesurez l’absorption des échantillons et des étalons à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 550 nanomètres.

La coloration au collagène du tissu hépatique avec le rouge Picro Sirius, observée par un éclairage de champ lumineux, a montré un rouge collagène avec un fond orange clair ou jaune. Le dépôt de collagène correspondant à la fibrose a été coloré ainsi que le collagène dans les parois des vaisseaux sanguins, le hilose et la capsule hépatique. La microscopie à lumière polarisée a révélé des fibres de collagène biréfringentes distinctes sur un fond sombre, améliorant la visualisation de la fibrose.

La quantification de la zone positive au collagène hépatique chez les souris jaunes d’agouti nourries avec un régime riche en graisses et fructose, ou HFFD, a montré une fibrose significativement plus élevée comparée aux souris témoins sauvages nourries avec un régime pauvre en graisses et en fructose. La quantification de la teneur en hydroxyproline hépatique a révélé un niveau significativement plus élevé chez les souris jaunes agouti nourries avec un régime HFFD par rapport aux souris témoins après 16 semaines de régime, confirmant une augmentation du dépôt de collagène dans les foies fibreux.