Isolement et évaluation par cytométrie en flux des interactions neuro-immunes dans un modèle murin de mini-AVC

Le champ de notre recherche se concentre sur la fonction des cellules immunitaires après un AVC ischémique. Notre objectif est de comprendre les lois des cellules immunitaires résidentes et infiltrantes dans la pathologie de l’AVC. Actuellement, la cytométrie en flux est largement utilisée pour évaluer la fonction des cellules immunitaires et les interactions dans les neuroinflammations.

De plus, les techniques d’immunothérapie et le séquençage de la cellule unique font progresser la recherche sur les interactions neuro-immunitaires. Notre laboratoire se concentrera sur l’illustration du trajet des astrocytes dans les interactions neuro-immunitaires, les contributions angio-inflammatoires aux processus neuro-inflammatoires. Pour commencer, prenez une seringue de 50 millilitres et fixez une aiguille de calibre 26 à son extrémité.

Remplissez complètement la seringue avec une solution saline. Positionnez la souris anesthésiée en position couchée sur une planche de mousse. Étendez les membres antérieurs et postérieurs et fixez-les à l’aide d’aiguilles de calibre 26.

À l’aide d’une pince à pouce dentelé, saisissez la peau abdominale et faites une incision latérale pour exposer le foie. Coupez le long des deux côtés des côtes pour exposer le cœur. Insérez maintenant l’aiguille de calibre 26 dans le ventricule gauche et sectionnez l’oracle droit.

Appuyez sur le piston de la seringue pour permettre au sang de s’écouler. Continuez la perfusion jusqu’à ce que le sang qui s’écoule de l’oracle apparaisse clair. Après avoir décapité la souris et extrait le cerveau, transférez-la dans une matrice de cerveau en acier de souris et coupez-la en tranches cornéennes consécutives de deux millimètres d’épaisseur.

Introduisez 500 microlitres de mélange d’enzymes de digestion dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. À l’aide de micro-pinces, séparez délicatement le tissu de l’infarctus et transférez-le dans le mélange d’enzymes de digestion. Enfin, fragmentez le tissu avec des ciseaux ophtalmiques en plus petits morceaux possibles et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

À l’aide de la pipette AP 1000, aspirez doucement et distribuez la solution 10 fois pour dissocier le tissu en cellules individuelles. Passez ensuite la solution dans une passoire à cellules de 70 micromètres. Rincez à plusieurs reprises la plaque à 12 puits et la crépine cellulaire avec du HBSS glacé contenant du calcium et du magnésium.

Centrifugez maintenant la suspension cellulaire collectée à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Remettez le granulé en suspension dans un millilitre de PBS.

Après avoir répété le processus de centrifugation, remettez à nouveau la pastille en suspension dans 150 microlitres de PBS et transférez la suspension dans une plaque inférieure ronde à 96 puits. Centrifugez à nouveau à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, saisissez fermement la plaque à 96 puits et retournez-la rapidement pour éliminer le surnageant.

Ensuite, diluez la matrice de fluorescence de viabilité cellulaire dans un rapport de un à cent dans du PBS et remettez la pastille en suspension dans 150 microlitres de la solution de colorant diluée. Incuber 10 minutes à température ambiante tout en protégeant la plaque de la lumière. Après une centrifugation de cinq minutes à quatre degrés Celsius, jetez le surnageant.

Diluez le cocktail d’anticorps de surface cellulaire dans le tri cellulaire activé magnétique ou le tampon maximum et sans laver les cellules, ajoutez le cocktail d’anticorps dans les puits. Incuber pendant 15 à 20 minutes à quatre degrés Celsius avant de centrifuger pendant cinq minutes supplémentaires. Après avoir centrifugé la plaque et jeté le surnageant, remettre le granulé en suspension dans 150 microlitres de tampon maximum.

Transférez la suspension dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre ou des tubes à essai en polystyrène à fond rond de cinq millilitres. Concevez un panel de cytométrie en flux multicolore en fonction de la configuration de l’instrument à l’aide de méthodes manuelles ou d’un outil de conception de panel en ligne. Inclure un colorant de viabilité cellulaire dans le panneau pour exclure les cellules non viables et les débris des données.

Ajustez les paramètres du détecteur de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale pour vous assurer que les cellules d’intérêt sont correctement affichées et peuvent être correctement fermées. Ajustez les paramètres FSC et SSC pour éliminer les débris et les bruits parasites. Sur un graphique à points montrant l’aire FSC en fonction de la hauteur, distinguez les doublets des cellules simples.

Utilisez le signal négatif du colorant de viabilité pour isoler les cellules viables. Comparez le contrôle d’autofluorescence à partir de cellules non colorées avec des contrôles positifs de cellules colorées pour confirmer que les cellules colorées sont correctement mises à l’échelle pour chaque paramètre. Affinez la compensation en analysant des échantillons de cellules multicolores et en examinant deux diagrammes de points de couleur.

Ajustez les paramètres de compensation vers le haut ou vers le bas jusqu’à ce que les populations de cellules s’alignent verticalement ou horizontalement les unes avec les autres. Utilisez les signaux CD45 et CD11B pour distinguer les lymphocytes, les cellules microgliales, les cellules myéloïdes et les astrocytes en fonction de leurs modèles d’expression spécifiques. Utiliser du tissu cérébral fictif comme contrôle de l’autofluorescence pour servir de référence pour l’identification des lymphocytes.

Si vous analysez une cible spécifique, utilisez un contrôle FMO avec du tissu cérébral post-AVC. Collectez les données de contrôle et enregistrez-les. De même, collectez les données de l’échantillon et enregistrez-les.

Sélectionnez et triez les populations cellulaires cibles en tubes à essai en polystyrène à fond rond de cinq millilitres ou en tubes à centrifuger coniques de 15 millilitres. Ajoutez 500 microlitres de PBS et rincez le tube de collecte pour préserver la viabilité cellulaire et favoriser la formation de granulés. Les microglies CCR7 positives et CD11c positives ont été quantifiées les deuxième et septième jours après un AVC ischémique.

L’expression de CCR7 dans la microglie a fortement augmenté le deuxième jour et est restée élevée le septième jour par rapport aux témoins fictifs. Les microglies CD11c positives ont suivi une tendance similaire, atteignant un sommet au deuxième jour et restant plus élevées que les cellules fictives le septième jour. Les diagrammes à points ont montré des signaux CCR7 et CD11c denses les deuxième et septième jours.

Contraste avec les signaux clairsemés dans les commandes fictives. Une stratégie de déclenchement a permis de séparer les cellules myéloïdes microgliales et les lymphocytes en utilisant l’expression de CD11B et CD45. Des marqueurs supplémentaires ont défini des cellules viables, des astrocytes et des sous-ensembles de lymphocytes.