Exploration des événements cellulaires séquentiels de la phagocytose déclenchée par Godanti Bhasma dans les cellules de mammifères

Phagocytose, où un phagocyte ingère et décompose des particules étrangères. C’est crucial pour la défense immunitaire. Des méthodes améliorées et conviviales sont nécessaires pour surveiller et évaluer efficacement ce processus cellulaire complexe.

Capturer les événements de dégradation en temps réel et éviter les artefacts du photoblanchiment restent des défis clés pour étudier avec précision la phagocytose et le trafic intracellulaire. Contrairement aux particules fluorescentes ou synthétiques, notre protocole utilise Godanti Bhasma, une particule sans marquage permettant une visualisation directe des stades de phagocytose sans photoblanchiment, optimisation ou préparation complexe. Ces résultats fournissent un modèle reproductible pour disséquer les mécanismes phagocytaires, offrant de nouveaux outils pour étudier la dynamique vésiculaire, le dysfonctionnement des agents pathogènes et l’intervention thérapeutique potentielle pour les troubles immunitaires et lysosomaux.

Notre objectif est d’explorer les régulateurs moléculaires des phagosomes de maturation, d’étudier le dysfonctionnement phagocytaire dans des modèles de maladies et de cribler des médicaments potentiels qui modulent la dynamique vésiculaire et le trafic intracellulaire. Pour commencer, pesez exactement 100 milligrammes de poudre Godanti Bhasma ou GB. Mettre la poudre en suspension dans 10 millilitres de DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine.

Mélangez soigneusement la suspension pour mélanger le contenu et laissez reposer le mélange pendant une minute pour permettre aux plus grosses particules de se déposer au fond. À l’aide d’une pipette, transférez les cinq millilitres supérieurs de la suspension dans un tube à centrifuger stérile. Étiquetez les cinq millilitres de suspension GB transférée comme solution mère pour d’autres travaux de culture cellulaire.

Tourbillonnez à nouveau la suspension à fond pour assurer une dispersion uniforme des particules avant de l’ajouter aux cellules. Semez 3 10 cellules de puissance 4 3T3-L1 dans une parabole de 35 millimètres contenant deux millilitres de DMEM. Incuber la parabole à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cellules atteignent 70 % de confluence.

Ensuite, mélangez soigneusement 300 microlitres de la suspension mère GB dans deux millilitres de milieu de culture frais préchauffé. Placez la boîte de culture contenant les cellules et la suspension GB sur l’incubateur de la platine du microscope d’imagerie. Sélectionnez l’objectif 10x sur le microscope.

Allumez l’éclairage en fond clair à l’aide du bouton Bright. Lancez ensuite le logiciel DIGI ImagePlus et sélectionnez l’appareil photo approprié. Cliquez sur le bouton Capturer et choisissez l’option time lapse.

Réglez l’intervalle de temps sur cinq minutes et démarrez l’enregistrement en cliquant sur le bouton Terminer. Capturez des images en champ clair à cinq minutes d’intervalle en continu pendant 16 à 24 heures à l’intérieur de l’incubateur de dioxyde de carbone de la platine du microscope. Utilisez le logiciel ImageJ pour compiler toutes les images capturées dans une vidéo time-lapse.

Cela permet d’identifier les stades de phagocytose, de l’internalisation des particules à leur dégradation complète. Après 24 heures de croissance cellulaire dans des plaques à 96 puits, mélangez soigneusement la suspension de particules GB. Ajoutez 30 microlitres de suspension dans chaque puits.

Utilisez des puits sans particules GB comme témoins négatifs. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour induire la formation de vacuoles. Pour préparer une solution de rouge neutre, dissolvez le rouge neutre pour obtenir une solution de 0,5 milligramme par millilitre dans du DMEM sans sérum.

Filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 micromètre. Pour l’imagerie, retirez le support des plaques à 96 puits. Après avoir ajouté 60 microlitres de colorant filtrant dans chaque puits, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Lavez les puits trois fois avec du PBS pour éliminer l’excès de colorant. Procédez ensuite à l’imagerie microscopique. Examinez les vacuoles colorées au microscope à l’aide de l’objectif 20x pour évaluer la taille, la morphologie et le nombre de vacuoles.

Pour préparer la solution mère de bafilomycine A1, dissolvez 100 microgrammes du composé dans 50 microlitres de diméthylsulfoxyde. Ensuite, diluez-le avec 950 microlitres de DMEM. Pour la solution de travail, diluez un microlitre de stock dans 1,6 millilitre de DMEM pour obtenir une concentration finale de 0,1 nanomolaire.

Mélangez soigneusement la solution de travail et ajoutez 100 microlitres dans les puits contenant les cellules dans les plaques de 96 puits. Ensuite, incubez les cellules dans chaque puits avec 30 microlitres de suspension de particules GB pour étudier l’inhibition de la formation de vacuoles et de phagosomes. Pour inhiber l’acidification des phagosomes, ajoutez 100 microlitres de la solution de travail de la bafilomycine A1 dans les puits avec des vacuoles préformées préalablement traitées avec GB. Incuber tous les puits à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Ajoutez 60 microlitres de colorant rouge neutre dans chaque puits. Incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius et laver les puits trois fois avec du PBS pour éliminer l’excès de colorant, puis analyser la formation de vacuoles et l’acidification au microscope. Traitez les cellules cultivées avec 50 microlitres de GB en suspension et incubez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone dans des conditions expérimentales standard.

Après le traitement, ajoutez une solution d’orange acridine à raison d’un milligramme par millilitre dans les cellules et incubez pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius pour colorer les vacuoles et les organites vésiculaires acides. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS stérile pour éliminer tout colorant non lié et réduire la fluorescence de fond. Enfin, analysez immédiatement les lames colorées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un objectif 20x et d’une plage de filtres d’excitation bleue de 450 à 492 nanomètres.

Évaluer la morphologie cellulaire et l’absorption de l’orange d’acridine pour comprendre la dynamique vacuolaire. Après 30 minutes de traitement par GB, des particules ont été observées attachées à la surface de trois cellules 3T3-L1. Une extension de membrane en forme de coupe est apparue autour de la particule, indiquant le début de l’engloutissement des particules.

12 heures après le traitement, de grandes vacuoles membranaires contenant des particules de GB ont été observées à l’intérieur des cellules. L’imagerie en accéléré a démontré l’internalisation par étapes et la formation de vacuoles dans une seule cellule vivante pendant 4,75 heures. Les particules de GB à l’intérieur des vacuoles se sont progressivement dégradées au fil du temps et la cellule a retrouvé une morphologie normale, comme l’indique le renouvellement vacuolaire.

L’analyse par cytométrie en flux a montré que les particules internalisées de Godanti Bhasma étaient complètement dégradées en 24 heures, sans qu’aucune particule ne reste dans le milieu de culture. La coloration rouge neutre a révélé une acidification des vacuoles significativement plus élevée dans les cellules traitées par GB des trois lignées cellulaires par rapport aux témoins qui ne présentaient qu’une faible coloration lysosomale. La coloration à l’orange acridine a montré une fluorescence rouge orangé dans les vacuoles des cellules GB 3T3-L1, indiquant une acidification, tandis que les cellules non traitées n’ont montré qu’une fluorescence verte.

Le co-traitement avec la bafilomycine a inhibé la formation de vacuoles dans les cellules 3T3-L1 et HeLa, comme en témoigne l’absence de vacuoles par rapport à leurs témoins respectifs. Après un traitement à la bafilomycine, l’absorption du rouge neutre a été efficacement bloquée, perturbant l’acidification des vacuoles et la maturation dans les cellules.