Un pipeline de concoction pour générer des unités taxonomiques opérationnelles moléculaires (MOTU) chez les coléoptères riverains et aquatiques

Cherchant à accélérer la découverte d’espèces dans les MEGA tropiques diversifiés, ce protocole vise à générer une hypothèse de regroupement d’espèces chez les coléoptères aquatiques et riverains en utilisant une concoction d’analyse informatisée.

Ce pipeline de concoction, qui a utilisé la séquence d’ADN COI, a conduit à de plus grandes preuves d’une délimitation d’espèce pour le coléoptère radeau du genre Anisostena, qui n’était auparavant érigé qu’à l’aide de données morphologiques.

Ce protocole vise à surmonter l’obstacle taxonomique que la découverte d’espèces par le biais de la taxonomie basée sur la morphologie, qui est considérée comme l’étalon-or en systématique des insectes, prend souvent du temps et est déroutante pour les coléoptères aquatiques sous-étudiés, mais MÉGA diversifiés et très discrets.

[Emmanuel] Ce pipeline génère des hypothèses accessoires moléculaires appelées MOTU, que la séquence corresponde aux espèces connues par les séquences référencées, ou que les espèces soient non découvertes ou non décrites.

Ainsi, plutôt que de disséquer et de comparer des centaines de structures génitales de coléoptères en même temps, le pipeline fournit un regroupement préliminaire sur lequel les spécimens peuvent être examinés pour déterminer leur conspécificité.

[Narrateur] Pour commencer, lancez MEGA X et chargez les séquences d’ADN pour l’alignement. Ouvrez l’interface d’alignement en sélectionnant une ligne, puis en cliquant sur Modifier ou Construire l’alignement, puis en choisissant Créer un nouvel alignement. Cliquez sur OK pour confirmer la sélection et sélectionnez ADN comme type de données. Passez la souris sur l’onglet d’édition. Cliquez sur insérer la séquence à partir du fichier. Naviguez jusqu’au répertoire approprié et sélectionnez les fichiers de séquence à charger dans MEGA. Maintenant, cliquez sur alignement, puis sélectionnez aligner par ClustalW pour aligner les séquences à l’aide des paramètres par défaut et cliquez sur OK pour continuer. Pour l’édition manuelle des séquences, supprimez toutes les insertions en cliquant sur les bases ou les positions insérées et en appuyant sur la touche Suppr du clavier. Ensuite, corrigez les suppressions en cliquant sur le tiret qui représente une base manquante, en la supprimant et en tapant la base prévue. Ensuite, trouvez la première position où toutes les séquences contiennent un caractère. Cliquez sur la case vide dans l’en-tête de la ligne immédiatement à gauche de cette position et faites-la glisser pour sélectionner toutes les positions de départ excédentaires. Appuyez sur Supprimer pour les découper. Ensuite, trouvez la dernière position alignée et cliquez sur la case à droite de ce point. Appuyez à nouveau sur Supprimer pour couper l’extrémité. Maintenant, sélectionnez toutes les séquences et cliquez sur l’onglet Séquences de protéines traduites. Lorsque vous y êtes invité, vérifiez que le code génétique est mitochondrial. Si le code génétique est différent, cliquez sur non et un menu apparaîtra, permettant de cocher la case pour le code génétique mitochondrial des invertébrés. Si les codons d’arrêt marqués d’un astérisque dans l’alignement apparaissent sur une colonne entière, cliquez sur les séquences d’ADN et supprimez la première position de toutes les séquences. Encore une fois, cliquez sur les séquences d’ADN, puis enregistrez l’alignement au format .mos ou .mosx. Pour lancer la délimitation à l’aide du module TaxonDNA, ouvrez le logiciel TaxonDNA. Cliquez sur importer, puis sélectionnez FASTA et téléchargez le fichier d’alignement au format FASTA. Maintenant, cliquez sur modules, puis sélectionnez cluster. Définissez la valeur de seuil sur 3 % et cochez la case Générer des informations individuelles sur chaque cluster. Cliquez sur créer des clusters maintenant pour commencer à clusteriser et enregistrer les résultats en prenant une capture d’écran. Pour la délimitation à l’aide de la méthode Kimura à 2 paramètres, ouvrez MEGA et cliquez sur fichier, puis sélectionnez ouvrir un fichier ou une session. Cliquez sur distance. Sélectionnez Calculer les distances par paires et confirmez le fichier .meg pour la délimitation. Passez la souris sur la zone en regard de modèle ou de méthode et cliquez sur la flèche pour développer le menu déroulant. Sélectionnez le modèle Kimura à 2 paramètres et cliquez sur OK pour exécuter le programme. Ouvrez la fenêtre de sortie de données pour afficher les résultats. Cliquez sur fichier, puis sélectionnez exporter et imprimer les distances pour enregistrer le résultat. Ouvrez le serveur web assemble species par partitionnement automatique ou ASAP. Cliquez sur la case orange étiquetée, choisissez un fichier et téléchargez le fichier .fasta. Faites défiler l’écran vers le bas et cliquez sur Aller. Pour télécharger le résultat du clustering, cliquez sur la liste de la ligne avec le score ASAP le plus bas et le classement de valeur P le plus élevé. Ensuite, pour démarrer l’estimation de l’arbre, ouvrez MEGA et cliquez sur données. Sélectionnez ensuite ouvrir un fichier ou une session pour charger le fichier .meg. Cliquez sur modèles, puis sélectionnez Trouver les meilleurs modèles d’ADN et de protéines ou ml pour déterminer le modèle de substitution le mieux adapté. Cliquez sur OK dans le menu des préférences d’analyse. Maintenant, pour générer l’arbre, cliquez sur phylogénie, puis sélectionnez construire et tester l’arbre de vraisemblance maximale. Utilisez le modèle de substitution le mieux adapté en cliquant sur la case à côté du modèle ou de la méthode et en sélectionnant le modèle approprié dans le menu déroulant. Sous Test de phylogénie, cliquez sur la case à côté de Test de phylogénie, puis choisissez la méthode bootstrap dans le menu déroulant. Cliquez sur la case à côté du nombre de réplications d’amorçage. Tapez 1 000 et cliquez sur OK pour exécuter l’analyse. Une fois que la fenêtre contenant l’arborescence résultante s’ouvre, enregistrez la session sous forme de fichier .mts ou .mtsx. Enregistrez également la sortie sous forme de fichier .newick et exportez l’arbre sous forme d’image .png. Pour la délimitation basée sur PTP, visitez le serveur Web PTP. Cliquez sur choisir un fichier et téléchargez l’arbre au format Newick. Sous mon arbre se trouve une sélection d’enracinements. Dans la zone sous Noms des taxons d’exogroupe, saisissez l’exogroupe en tapant le nom de l’astuce du taxon. Ensuite, sous Solution de vraisemblance maximale, cliquez sur Télécharger les résultats de délimitation pour enregistrer la sortie PTP ML. De même, sous la solution bayésienne la plus élevée prise en charge, cliquez sur télécharger les résultats de la délimitation pour enregistrer la sortie BI PTP. Pour connaître la limitation MPTP par MPTP, visitez le serveur Web MPTP. Téléchargez le fichier Newick en le faisant glisser sur le carré gris ou en cliquant sur le carré. Une fois les données chargées, cliquez sur procéder à la sélection de l’exogroupe. Sur la page de spécification de l’exogroupe, sélectionnez l’exogroupe en cochant la case à côté des étiquettes des taxons des spécimens de l’exogroupe. Ensuite, cliquez sur la sélection du modèle, sélectionnez MPTP, puis cliquez sur les options de visualisation. Sur la page des options de visualisation, acceptez les paramètres par défaut. Cliquez sur soumettre. Faites un clic droit sur les fichiers sous les fichiers téléchargeables et choisissez Enregistrer sous pour enregistrer les résultats. Maintenant, pour générer les unités taxonomiques opérationnelles moléculaires ou MOTU, ouvrez l’arbre à l’aide d’un programme de retouche photo ou de PowerPoint. Créez une barre pour représenter les résultats de chaque approche de délimitation moléculaire des espèces. Si toutes les approches donnent des résultats identiques pour un amas moléculaire donné, désigner l’amas comme un MOTU par consensus. Cette figure présente les résultats de l’arbre génétique du maximum de vraisemblance et du regroupement moléculaire pour les coléoptères Boranus sur la base des séquences COI 3-prime et de six méthodes de délimitation. Toutes les méthodes ont systématiquement identifié quatre MOTUS, Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini, Byrrhinus A et Byrrhinus B, avec un regroupement identique entre les méthodes. Byrrhinus negrosensis et Byrrhinus villarini étaient clairement séparés, bien qu’ils proviennent des mêmes endroits. Les séquences de quatre provinces ont été regroupées en Byrrhinus A, ne montrant pas de forte structuration géographique. Cette figure montre le regroupement des coléoptères Anisostena en quatre MOTU, y compris Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A et Anisostena B, avec une concordance totale entre les méthodes. Anisostena auxilium chevauchait géographiquement Anisostena A et Anisostena B, indiquant que la géographie seule n’expliquait pas la divergence moléculaire.