In vivo Imagerie de l’activité neuronale chez des mouches adultes drosophiles non anesthésiées

Nous essayons de comprendre les bases moléculaires, cellulaires et des circuits de l’oubli de la mémoire naturelle, dans le but de découvrir comment le cerveau efface ou supprime activement les souvenirs pour maintenir la flexibilité cognitive. Des recherches récentes ont montré que l’oubli n’est pas simplement une décomposition passive des souvenirs, mais plutôt un processus biologique actif hautement régulé qui nécessite des modèles spécifiques d’activité neuronale.

Un défi majeur est de relier des manipulations de circuits spécifiques à des processus de mémoire dynamique tout en intégrant des données connectomiques, génétiques et comportementales de manière rigoureuse et interprétable. Nous avons contribué à établir que l’oubli est un processus actif et biologiquement régulé. Nos travaux ont identifié des neurones dopaminergiques spécifiques et des voies moléculaires nécessaires à l’oubli normal dans le cerveau de la drosophile. Notre protocole permet l’imagerie fonctionnelle chez les mouches sans anesthésie, empêchant ainsi les effets indésirables non spécifiques des anesthésiques. Nous utilisons cette approche pour étudier les corrélats neuronaux sous-jacents à la formation de la mémoire et à l’oubli de la mémoire active.

[Narrateur] Pour commencer, utilisez des outils Dremel et une lame de scie diamantée pour couper un tube métallique hypodermique de calibre 22 à une longueur d’environ 10 centimètres. À l’aide d’une meule à tronçonner Dremel 420, polissez les deux extrémités du tube pour créer une ouverture lisse et propre qui peut accueillir la trompe de la mouche. Enroulez le tube coupé autour d’un tube à centrifuger de 15 millilitres pour former la forme incurvée souhaitée. Ensuite, coupez un morceau de 7 centimètres de long de tube métallique hypodermique de calibre 12. Utilisez maintenant une lame de rasoir pour couper l’extrémité d’une pointe de pipette de 2 microlitres afin de l’adapter au tube métallique de calibre 22. Insérez le tube de calibre 12 dans l’autre extrémité de la pointe de la pipette. Ensuite, mélangez une petite quantité de résine époxy et de durcisseur. Appliquez l’époxy aux jonctions où le petit tube métallique rencontre la pointe de la pipette et où le plus grand tube se connecte à l’autre extrémité. Laissez l’époxy durcir complètement pendant la nuit avant de connecter l’ensemble à un support de micromanipulateur et d’ajuster l’angle si nécessaire. Pour construire une pipette de choc et d’odeur, coupez 1 millilitre d’une pipette en verre 1 x 100 à la marque de 3 millilitres à l’aide d’un outil diamanté Dremel. Découpez ensuite une petite feuille acrylique rectangulaire mesurant 24,5 millimètres x 8 millimètres d’une épaisseur de 1/8e de pouce. Découpez une grille de choc en cuivre pour l’adapter à la pièce rectangulaire en acrylique. Soudez deux fils électriques aux extrémités opposées de la grille en cuivre. Placez maintenant la grille de cuivre sur la pièce en acrylique et pliez-la légèrement pour s’adapter à l’abdomen et aux pattes de la mouche. Utilisez du ruban isolant pour fixer la grille de cuivre à la pièce acrylique. Ensuite, à l’aide d’un pistolet à colle chaude, fixez la pipette en verre à la grille de choc, en vous assurant qu’elle est droite et centrée. Pour construire la chambre d’enregistrement, prenez une lame de microscope en verre comme base de la chambre. Mélangez la résine et la colle époxy. À l’aide de la colle époxy, fixez des aimants en néodyme aux quatre coins d’une chambre en acrylique noir. Placez un aimant supplémentaire sur chaque aimant collé. Collez ensuite les aimants nouvellement placés sur une lame de verre à l’aide d’époxy. Maintenez l’ensemble en place avec des trombones pendant le durcissement. Retirez l’embout de pipette de 200 microlitres de l’aspirateur. Insérez l’aspirateur dans un flacon contenant la drosophile et aspirez une seule mouche dans l’embout de la pipette de 1 000 microlitres. Replacez l’embout de la pipette de 200 microlitres sur l’aspirateur. Ensuite, soufflez doucement et secouez l’aspirateur de manière à ce que la mouche soit immobilisée la tête la première au sommet de la pointe de la pipette de 200 microlitres. Ensuite, placez la chambre de dissection sur le support du manipulateur. Connectez l’aspirateur au tube de retenue des mouches et ajustez le débit à environ 500 millilitres par minute. Déplacez maintenant le tube métallique du vide au centre du champ de vision du microscope. Aspirez doucement la trompe des mouches dans le support à vide. Ajustez le manipulateur pour aligner la tête de la mouche avec l’ouverture de la chambre. Allumez l’alimentation en courant continu. À l’aide d’un fil de résistance en platine, appliquez de l’acide myristique fondu pour coller les yeux et le thorax à la chambre. Une fois fixé, débranchez le tube d’aspiration. Retirez la chambre d’enregistrement de la connexion à vide à l’aide du manipulateur et retournez la chambre. Collez ensuite la trompe par le bas à l’aide d’une résistance au platine. Lorsque tout a été collé, coupez l’alimentation en courant continu. Retournez ensuite la chambre à la verticale. Fixez la chambre à la base de la lame en verre. Coupez un petit morceau de ruban adhésif avec des ciseaux et placez-le devant et derrière la tête de la mouche. Faites pivoter la chambre de manière à ce que la tête de la mouche fasse face à l’expérimentateur à un angle de 90 degrés. À l’aide d’une aiguille de dissection, faites des incisions verticales le long des côtés des yeux. Faites pivoter la chambre horizontalement. Faites ensuite une coupe horizontale à travers la cuticule. Ajoutez maintenant 100 microlitres de solution saline sur le dessus de la tête de la mouche. À l’aide d’une pince bien aiguë, retirez la fenêtre de la cuticule, puis retirez tout reste de graisse ou de trachée avec la pince. Placez une mouche préparée sur la platine d’un microscope confocal équipé d’un laser et d’un objectif à immersion dans l’eau. À l’aide d’un micromanipulateur, ajustez la position de la grille de choc et de la pipette à odeurs afin que la mouche soit correctement positionnée sur la grille de choc. Utilisez le bouton de réglage de la trajectoire z pour balayer l’axe z du cerveau et localiser la région cérébrale d’intérêt. Définissez la taille de l’image sur 512 x 512 pixels. Commencez l’enregistrement à partir du neurone d’intérêt à l’aide d’un système de diffusion d’odeurs fabriqué sur mesure ou disponible dans le commerce. Réglez la durée d’enregistrement sur 2 minutes. Lancez le protocole d’entraînement à l’aide du système de diffusion des odeurs 5 minutes après avoir recueilli les réponses avant l’entraînement. Enregistrez ensuite les réponses post-entraînement environ 5 à 15 minutes après l’entraînement. L’indicateur calcique GCaMP6f et la protéine fluorescente rouge tdTomato ont été exprimés sélectivement dans le neurone de sortie du corps du champignon avec des dendrites projetées dans les lobes gamma et alpha du corps du champignon, et le neurone a été visualisé à l’aide de la ligne pilote MB077C split-GAL4. Les réponses calciques dans le neurone de sortie du corps du champignon au 3-octanol ont été significativement réduites 5 minutes après le conditionnement inverse sans anesthésie et sont restées supprimées à 15 minutes. En revanche, les réponses calciques au 4-méthylcyclohexanol étaient significativement améliorées 5 minutes après l’entraînement et restaient élevées à 15 minutes. Les images pseudo-couleurs ont montré des changements de fluorescence distincts avant et après l’entraînement. Chez les mouches anesthésiées, les réponses calciques post-entraînement à la CS+ n’étaient que partiellement réduites et les réponses à la CS- n’étaient pas significativement différentes de celles de base. L’analyse quantitative a confirmé que la réponse CS+ était significativement déprimée après l’entraînement chez les mouches anesthésiées, mais les réponses CS- sont restées statistiquement inchangées. La plasticité était significativement plus élevée chez les mouches non anesthésiées par rapport aux mouches anesthésiées.